一般生殖毒性试验方法原则
食品毒理学--第八章--生殖毒理学精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版第八章生殖毒理学和发育毒理学第一节概述一、哺乳动物的繁殖过程--生殖发育过程，是哺乳动物繁衍种族的生理过程生殖发育其中包含生殖细胞发生，即精子发生和卵细胞发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程、直至性成熟的整个过程。
二、外源化学物对生殖发育的影响➢干扰生殖发育的任何环节并造成损害作用。
➢可以通过对内分泌系统特别是对性腺的作用，发生间接的影响。
➢神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。
外源化学物对生殖发育损害作用的特点➢生殖发育过程较机体其他系统更为敏感➢外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远➢生殖毒理学(reproductive toxicology)主要研究外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。
➢发育毒理学(developmental toxicology)主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
第二节生殖毒性及其评定一、生殖毒理学历史。
二、生殖毒性外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。
雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等；雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。
1、外源化学物的雄性生殖毒性对睾丸生精细胞的影响对内分泌功能的影响对性功能和生殖功能的影响1）对睾丸生精细胞的影响●棉酚影响睾丸功能的典型外源化学物CS2 工业污染物引起睾丸萎缩，精子生成障碍；对生殖细胞有致突变作用。
●重金属铅、镉、汞、锰等损害形态、功能，如精子畸形率↑、精子数和精子活动率↓●农药生精↓、精子畸形率↑、睾丸萎缩、性功能减退等2）对内分泌功能的影响精子数目、精子的发育成熟、活动率、活动能力等3）对性功能和生殖功能的影响性欲功能降低、阳痿、雄性不育等2、外源化学物的雌性生殖毒性●对卵细胞的影响●对内分泌的影响●对子代生长发育的影响环境因素尤其是化学物工业污染物、农药、重金属、毒素等三、生殖毒性的评价外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。
药物生殖毒性研究
• 白鼬：
• 如果不采用特殊的管理系统，只能季节性 繁殖（其成功与否主要取决于人和动物的 相互影响），历史背景资料不足。
• 仓鼠：
• 静脉给药虽非不可能，但相当困难，会将 受试物存于颊部小囊中而影响实际给药量
• 攻击性非常强
• 对肠道功能紊乱敏感，对许多受试物有过 度敏感的致畸反应，胎仔小。
• 犬：
终末检查：
•-剖检所有亲代动物
•-保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行 组织学检查，同时保留足够的对照组动物的 相应器官以便比较
•-保存所有动物的睾丸、附睾或卵巢、子宫， 必要时进行组织学检查，根据具体情况进行 评价
•-建议计数附睾中的精子数并进行精子活力检 查
胚胎-胎仔发育毒性试验（II段）
• 此外，还应进行第二种动物胚胎-胎仔发育
• 两段试验设计（啮齿类动物）
• 最简单的两段试验设计为生育力试验和围 产期试验。
• 目前研究认为，如果受试物在动物中的暴 露量达到人体暴露量以上的足够范围时， 围产期试验中并未发现其对产前发育有影 响，那么在大多数情况下，再进行胎仔检 查也不能显著改变其危险性评价的结果。
• 终末检查： • -剖检所有成年动物 • -保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进
行组织学检查，同时保留足够的对照组动 物相应器官以便比较 • -计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算 着床数 • -胎仔体重，胎仔顶臀长 • -胎仔异常（包括外观、内脏、骨骼）
• 胎仔骨骼检查
围产期毒性试验（III段）
• 低剂量应为生殖毒性方面的NOAEL。 • 高剂量与低剂量间根据具体情况可设计1～
2个剂量，以观察可能的剂量反应关系。
• 4.2 给药途径 • 一般情况下，给药途径应与临床拟用途径
安全性评价及生殖毒性
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局部用药特殊毒性研究
刺激性 给药部位的可逆性炎症改变
过敏性（变态反应或超敏反应）
特异性免疫反应，表现为组织损伤或生理功能紊乱，异常或病理性的
Ⅰ型，快发或速发过敏型，IgE介导 Ⅱ型，细胞毒型或溶细胞型，IgG介导 Ⅲ型，免疫复合物型或血管炎型，IgG、IgM介导 Ⅳ型，迟发型或结核菌素型，T淋巴细胞介导 光敏性
药物特别容易损害DNA或影响快速生 长组织需要的细胞蛋白功能或细胞呼吸。
DNA损害 蛋白质损伤
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二）下丘脑-垂体-性腺轴激素调节
下丘脑-垂体-性腺轴 雄激素 黄体生成素（LH） 促性腺激素释放激素（GnRH）
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三、女性生殖毒理学 女性生殖毒理学
女性生殖系统的功能
交配 受 胚胎形成及
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一、生殖毒性和发育毒性常用的术语
1、胚胎毒性 指药物对胚胎的选择毒性
作用。
2、胚胎毒物 具有胚胎毒性的物质。 3、致畸性 指胚胎在器官发育期接触药
物后，能造成永久性结构或 功能畸形。
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4、致畸剂 具有致畸性并使出生缺
陷发生率明显增加的物质。
Effect Level
最小毒性反应剂量 最大耐受量（MTD）：Maximal Tolerance Dose 最小致死剂量（MLD）：Minimal Lethal Dose 半数致死量（LD50）：Median Lethal Dose
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长期毒性研究
相关动物 给药途径 剂量 毒代动力学——药代研究在毒理学研究的延伸 阶段性——以不同给药期限的长期毒性研究来 分别支持药物进入Ⅰ 期、Ⅱ期或Ⅲ期临床试验 （生产）
2023年毒理学之生殖毒理学解读
生殖毒作用的靶标与环节
四、对卵巢、子宫和阴道的毒性 1.生殖细胞 ：所有卵母细胞在雌(女)性出生前就已存在，
如果破坏了就没有额外的配子可补偿；最敏感的阶 段是卵原细胞的有丝分裂期。 2. 颗粒细胞 为卵母细胞正常发育提供所需的激素和营 养环境。 3. 卵泡膜细胞 具有17α羟化酶将孕酮转化为雄烯二酮
黄体细胞 LH 催乳激素
孕激素,松驰素 催产素
卵泡膜细胞
LH
垂体
LH
FSH 卵巢
卵 子
发
颗粒
生
细胞
雄激素 芳香化酶
卵原细胞(休止状态) 2n 有丝分裂(青春期)
初级卵母细胞 2n 减数分裂
次级卵母细胞 n 减数分裂
卵细胞 n
雌激素
成熟卵子
雌性生殖系统
生长发育
性成熟
配子释放
新生儿适应 分娩
配子发生
受精 合子转运
生殖毒作用的靶标与环节
毒物对卵巢的毒作用方式：
1. 促性腺激素分泌不足、卵泡发育障碍或胆固醇合成障碍均可 导致卵巢萎缩，并继发性引起子宫和阴道萎缩；
2.
如可卡因、环磷酰胺、多环芳烃、无机汞等。
2. 某些化学物是雌激素和孕酮的拮抗剂或激动剂引起卵巢萎缩； 如他莫昔芬、甲氧基醋酸孕酮等。
3. 血清促性腺激素水平升高或卵巢胆固醇激素的负反馈调节失 灵均可引起排卵周期异常。如外源性LH、FSH催乳素等。
殖距离、外生殖器结构
雌性性功能和生育力的特异终点
器官重量 组织病理学
动情周期的正常性 激素水平 性行为 哺乳
发育
衰老
卵巢、子宫、阴道、垂体
卵巢、子宫、阴道、垂体、输卵管、 乳腺 阴道涂片细胞学
LH、FSH、雌激素、孕酮、催乳激素
生殖毒性试验流程及意义
啮齿类动物生殖毒性I、II、III段实验流程及意义1.概述生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。
包括：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）、胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）、围产期毒性试验（III段）。
生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示：图1. 动物生命周期划分A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。
B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。
C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。
D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。
E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。
F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。
各段试验研究阶段如下：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）：C-D围产期毒性试验（III段）：C-F1一般试验设计简介1.1受试物生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。
1.2实验动物首选啮齿类动物为大鼠。
在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。
1.3给药1. 3.1计量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。
高剂量：应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。
低剂量：应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量（NOAEL）”。
1.3.2给药途径：给药途径应与临床拟用途径一致（不用腹腔注射途径，因腹腔注射会对胎儿及子宫产生直接影响）。
生殖发育毒性
1992年以来，Carlson等相继报道近 年来成年 年以来， 等相继报道近50年来成年 年以来 等相继报道近 男子的平均精子数减少近一半, 男子的平均精子数减少近一半 同时男性生殖系统 发育异常如隐睾、尿道下裂、 发育异常如隐睾、尿道下裂、睾丸癌等疾患的发病 率升高; 女性乳腺癌的发生率近年来每年以1%的速 率升高 女性乳腺癌的发生率近年来每年以 的速 度增长。另外,许多野生动物生殖器官发育异常 许多野生动物生殖器官发育异常, 度增长。另外 许多野生动物生殖器官发育异常 如 睾丸和外生殖器变小, 生育力下降。 睾丸和外生殖器变小 生育力下降。 并认为这些异 常改变与环境化学因素有关, 提出了环境雌激素、 常改变与环境化学因素有关 提出了环境雌激素、 环境内分泌干扰物等概念 1996年Theo Colborn等著 年 等著Our Stolen Future 指出 等著 环境激素” 对人类生存的地球的危害， “环境激素” 对人类生存的地球的危害，该书被 译成15种语言在世界各地销售 种语言在世界各地销售。 译成 种语言在世界各地销售。
母体毒性出生前1天处死母鼠检查胚胎毒性和胎儿毒性部位脊柱腹部肛门脑突出露脑颅脊柱裂单纯性脑膜膨出单鼻孔鼻孔扩张小眼无眼开眼眼异位脊柱膜膨出脊柱骨缺失脊柱侧凸脐疝短尾卷尾角形尾螺旋尾无尾肛门闭锁常见畸形及部位常见畸形及部位外观畸形部位颅顶骨枕骨颈椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨尾椎骨缺损骨化迟缓缺损骨化迟缓缺损骨化迟缓缺损错位骨化迟缓多肋少肋短肋分叉肋波状肋融合肋缺失分裂变形多骨缺失缺失缺失椎弓不连续融合常见畸形及部位常见畸形及部位骨骼畸形骨骼畸形部位心血管气管食管子宫脑积水脑室扩大短舌分叉舌少眼小眼无眼右位心室中隔缺损单房室心主动脉弓肝异位少叶马蹄肾肾积水肾积水肾缺失肾异位子宫缺失常见畸形及部位内脏畸形在妊娠终止期常规测定的终点着床位点数黄体数着床前胚胎丢失数吸收胎和死胎数有畸形和变异的活仔数受影响的胎仔数非存活和畸形的胎儿体重在出生后测定的终点死产数活仔生存数出生时第一周断乳时活仔生长出生时出生后不同时间发育的生理标志如阴道开口等神经行为发育和功能发射发育运动发育活动性感觉功能社会生殖行为认知功能神经病理学和脑重量其它器官功能如肾脏心血管放射原子武器放射性碘放疗感染巨细胞病毒疱疹病毒和细小病毒b19风疹病毒梅毒弓形体水痘病毒委内瑞拉马脑炎病毒母体代谢失衡酒精中毒绒毛膜采样60天前地方性呆小病糖尿病叶酸缺乏高热苯丙酮尿症和sjogrens综合征风湿病和先天性心脏传导阻滞virilizing肿瘤人类致畸物肯定的人类致畸物肯定的人类致畸物一一药物和环境化学物氨基喋呤和氨甲喋呤雄性激素可卡因香豆素抗凝剂环磷酰胺己烯雌酚enalapriletretinate碘化物和甲状腺肿有机汞美赛唑和头皮缺陷羊膜腔内注射美蓝青霉胺13顺式视黄酸四环素甲苯滥用355三甲基24二氧恶烷唑丙戊酸人类致畸物肯定的人类致畸物肯定的人类致畸物二二酰胺咪嗪香烟秋水仙素双硫仑戒酒硫维生素a大剂量喹宁自杀剂量链霉素锌缺乏可能的人类致畸物致畸物最常见的主要畸形表现反应停酒精己烯雌酚三甲双酮氨基喋呤和氨甲喋呤链霉素四环素短肢畸形肢带发育不良耳畸形生长迟缓睑裂缩小小头智力低下阴道腺病宫颈糜烂和宫颈嵴阴道腺癌鼻软骨发育不良cns缺陷先天性钙化性软骨发育不良生长迟缓异常颅面容貌特征小头畸形精神发育迟缓发育迟缓v型眉低耳唇腭裂流产脑积水生长迟缓精神发育迟缓耳聋或听力损害牙斑齿釉质发育不良已确定的人类致癌物引起的畸形表现一致畸物最常见的主要畸形表现电离辐射糖尿病碘缺乏苯丙酮尿
化学毒物的生殖毒性
完整的生殖发育过程细分为如下阶段。
A阶段 交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能， 配子的发育与成熟，交配行为，受精。
B阶段 受孕到着床：检查成年雌性生殖功能，胚胎着 床前发育、着床。
C阶段 着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能，胎 体发育，主要器官形成。
D阶段 硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、 胎体的发育与生长，器官的发育与生长。
人是第3～8周（又称胚期）。这期的特点是细胞移动 和组合，形成器官原基，四肢和颜面形成等。这时期 特别容易诱发器官结构的缺陷，即结构畸形，故又称 敏感期；也可能引起胚胎死亡。
啮齿类胚胎死亡后被吸收，称为吸收胎 （resorption），在人则以流产告终，人的胚 胎约50％死亡。
畸形的发生取决于化学毒物的性质、剂量 以及给予的时间。在胚胎期中不同日给予致畸 物会诱发不同器官畸形，因为不同器官的敏感 期有差别，过早或过迟反而不引起畸形。
(二)精子穿透试验：
(三)睾丸中标志酶活性的测定：
一类为透明质酸酶、山梨醇脱氢酶(SDH)、乳 酸脱氢酶同工酶x(LDH-x)、5-核苷酸酶、α磷酸甘油脱氢酶等，在精母细胞和精细胞中 首先出现，其含量和活性随精子的形成、成 熟而达到高峰。
另一类为6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、 三磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、γ谷氨酰转肽酶、尿苷二磷酸酶、鸟氨酸脱羧 酶等，在睾丸足细胞、间质细胞或精原细胞 内含量最高，其含量和活性在性成熟前达到 高峰，并随精母细胞、精细胞和精子的形成、 成熟而降低。
4、发育毒性(development toxicity)：化学毒物 在着床前胚泡、器官形成，胎儿和新生儿各发 育阶段干扰正常发育过程，称为发育毒性。
不同的化学毒物作用于不同发育阶段。过早或过迟接
生殖毒性试验 繁殖试验流程
生殖毒性试验繁殖试验流程英文回答：Reproductive toxicity testing is an essential component of safety assessment for chemicals and pharmaceuticals. It aims to evaluate the potential adverse effects of a substance on reproductive organs and processes, including fertility, pregnancy, and development of offspring. The reproductive toxicity testing typically includes a range of studies, such as fertility assessment, mating and gestation studies, and developmental toxicity studies.The reproductive toxicity testing process usuallystarts with a screening study to determine the general reproductive effects of the substance. This may involve exposing male and female animals to different doses of the substance and monitoring their reproductive parameters, such as mating behavior, fertility, and pregnancy outcomes. The screening study helps to identify any potential reproductive effects and establish dose levels for furtherstudies.Following the screening study, more detailed reproductive toxicity studies are conducted. These studies often involve exposing animals to the substance during specific stages of reproduction, such as pre-implantation, organogenesis, or lactation. The effects on fertility, pregnancy, and development are carefully monitored and assessed. For example, in a developmental toxicity study, pregnant animals are exposed to the substance and evaluated for any adverse effects on fetal growth, development, and survival.In addition to the reproductive parameters, other endpoints such as hormonal changes, histopathological examination of reproductive organs, and genetic toxicity may also be evaluated. These endpoints provide valuable information on the mechanisms of reproductive toxicity and help in the overall risk assessment of the substance.Reproductive toxicity testing is guided byinternational guidelines, such as those developed by theOrganization for Economic Co-operation and Development (OECD). These guidelines provide standardized protocols and criteria for conducting and interpreting the results of reproductive toxicity studies. Compliance with these guidelines ensures the reliability and comparability of the data generated across different laboratories and countries.中文回答：生殖毒性试验是化学品和药物安全评估的重要组成部分。