蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法
1、透析和超过滤 w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 w半透膜为玻璃纸或纤维素材料
加
压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
利用蛋白质分子不能穿越半透膜的性质,将蛋白提取液置 于透析袋中,透析袋置于纯水,蒸馏水,或缓冲液中,蛋白质 溶液中的小分子物质穿越半透膜,从而实现纯化蛋白质的 目的.
• 从离心管底部钻空,分段收集 样品,实现蛋白质分离
3、凝胶过滤
凝胶一般由葡聚糖制 成,含有很多微孔
小分子蛋白质进入微 孔内,因而滞流时间长
大分子蛋白质不能进 入微孔而径直流出
3、凝胶过滤
（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀
2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法
w降低介电常数 w争夺水化膜
等电聚焦电泳
双向电泳
（三）利用电荷差异
离子交换层析 蛋白质按照在相应pH条
件下所带电荷的不同而 以不同的速率向下移动 带有更多负电荷的蛋白 质以更快的速率被洗脱 分段收集渗出液,实现蛋 白质的分离
（四）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法
具有பைடு நூலகம்强的专一性
亲和色谱颗粒
利用压力或离心力,强 行使水或其他小分子 溶质透过半透膜,而使 蛋白质留在膜上,以达 到纯化的目的(脱盐和 浓缩)
2、密度梯度离心
• 将蔗糖溶液加入离心管中进行 离心建立蔗糖梯度
• 仔细将蛋白质样品(混合物)加 入蔗糖梯度的顶端,再次离心 沉降
• 当蛋白质达到和自己相同的密 度梯度时停止移动
• 于是在不同的蔗糖梯度中存在 的蛋白质不同
掌握蛋白质分离与纯化的基本技能
掌握蛋白质分离与纯化的基本技能蛋白质是生命体内最重要的大分子物质之一，它们是生命体内各种功能分子的基础。
蛋白质的分离与纯化技术在许多生物学、生物化学、分子生物学等领域中发挥着重要的作用。
蛋白质分离与纯化的目的是获得纯度高、活性好、结构正确的蛋白质。
本文将从蛋白质的分离、纯化和检测三个方面，介绍蛋白质分离与纯化的基本技能。
一、蛋白质的分离1. 胶体电泳胶体电泳是一种基于蛋白质负电性和大小的分离技术。
该技术通过电场的作用，将蛋白质分离在聚丙烯酰胺凝胶中。
根据蛋白质分子的大小和电荷大小，蛋白质会在凝胶中分离出多条带。
通过分析带的位置、形状和强度，可以对蛋白质进行初步的分离和鉴定。
2. 离子交换层析通过离子交换层析，可以将蛋白质从混合物中分离出来。
离子交换层析原理是，将待分离混合物加入到离子交换树脂中，蛋白质分子根据相对的电荷大小，以及树脂上离子交换基团和蛋白质之间的相互作用，实现分离。
3. 亲和层析亲和层析是一种针对特定目标蛋白质的分离技术。
原理是将目标蛋白质与具有特异性亲和力的亲和剂结合，然后通过洗脱步骤，将目标蛋白质从其他混合物组分中分离出来。
二、蛋白质的纯化1. 洗脱纯化洗脱纯化是一种常用的蛋白质纯化方法。
洗脱纯化步骤包括分离、检测、定量、预处理、分组、洗脱和检测等步骤。
这种方法可以去除杂质，提高蛋白质纯度，但洗脱成本较高。
2. 溶剂沉淀法溶剂沉淀法是一种简单、快速的蛋白质纯化方法，利用特定条件下蛋白质溶解度的变化，使其从溶液中沉淀出来。
该方法适用于大分子蛋白质的纯化。
3. 进一步纯化针对不同的蛋白质，可以选择不同的进一步纯化方法。
例如，对于糖基化蛋白质，可以通过组成分析去除糖基化残基等。
此外，还可以采用管柱层析、超滤、凝胶渗透层析等方法进行更进一步的纯化。
三、蛋白质的检测1. 运用蛋白质电泳在蛋白质电泳步骤中，可以通过不同的染色方法对不同的蛋白质进行定位。
2. 免疫测定法通过免疫测定法，可以检测特定蛋白质分子。
生物化学实验-蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
小
结
粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级 等方法；
细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换 层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可 采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步 骤。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
蛋白质分离纯化
凝胶层析
原理：
1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗 脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子 物质迁移速度快；
注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
离子交换层析
可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；
蛋白质分子量的测定
最小分子量测定法 如Mb含Fe为0.335%，则
M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。
其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe 的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法 测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
蛋白质的分离纯化PPT
（二）Protein的分离纯化
1、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以 将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集 形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质
。 的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀
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4、凝胶过滤（303页）（凝胶层析）(gel filtration chromatography):又 叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-gel P)和琼脂糖凝胶(Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化， 以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。 5、离子交换层析： 6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。
2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化蛋白质。
3、沉降系数（S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉
降分子的大小特性 。
三、Protein的变性与复性
1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化 性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是 高级结构破坏、一级结构不变。
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SDS（十二烷基磺酸钠） 是一种阴离子型表面活 性剂，它能够与蛋白质 多肽链中的氨基酸残基 按大约1 2比例结合。
这样，每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
蛋白质纯化分离方法
蛋白质纯化分离方法
蛋白质纯化分离方法是指通过一系列的技术手段,将混合物中的目标蛋白质分离出来,以便于后续的研究和分析。
蛋白质是生物体内最重要的分子之一,是生命活动的重要驱动力。
在科学研究和工业生产中,蛋白质纯化分离技术具有重要的应用价值。
蛋白质纯化分离的方法有很多种,其中最常用的方法是免疫纯化法和化学纯化法。
免疫纯化法是指利用免疫筛选技术,将目标蛋白质与杂质分离开来。
化学纯化法则是利用化学反应或物理分离技术,将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
除了免疫纯化和化学纯化法,还有其他一些蛋白质纯化分离的方法,如磁选、电泳分离、沉淀法、离心法等。
这些方法各有优缺点,选择何种方法取决于混合物的特点和目标蛋白质的性质。
免疫纯化法和化学纯化法是最常用的蛋白质纯化分离方法。
免疫纯化法的优点在于操作简单、分离效率高、结果可靠,适用于多种蛋白质的纯化。
化学纯化法的优点在于分离精度高、纯化效率高、结果稳定,适用于高含量蛋白质的纯化。
除了这两种方法,还有其他一些蛋白质纯化分离的方法,如磁选、电泳分离、沉淀法、离心法等。
这些方法各有优缺点,选择何种方法取决于混合物的特点和目标蛋白质的性质。
蛋白质纯化分离技术的发展,为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
在蛋白质纯化分离的过程中,需要考虑到混合物的特点、目标蛋白质的性质、纯化方法的选择等因素,以确保蛋白质的纯化质量和结果的可靠性。
分离纯化的基本步骤
蛋白质分离纯化的基本步骤蛋白质分离纯化分为四个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎(二)蛋白质的抽提（三）蛋白质粗制品的获得（四）样品的进一步分离纯化。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
电泳法纯化分离蛋白质流程
电泳法纯化分离蛋白质流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。
蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：
一、根据分子大小不同分离纯化：
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
1、透析和渗滤：
主要利用半透膜
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
2、离心
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。
3、凝胶过滤
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
二、根据溶解度不同分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。
常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
1、等电点沉淀和pH值调节
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。
每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低；相反，有些蛋白质在一定pH 值时很容易溶解。
因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
2、蛋白质的盐溶和盐析
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。
同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。
盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。
由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。
为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。
利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者
凝胶过滤的方法除去中性盐。
3、有机溶剂法
原理：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低；而且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。
由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。
因此，通常要将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。
对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取液。
冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。
冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。
4、双水相萃取法
双水相萃取技术是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离物在两相中分配的不同，便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
此方法可以在室温环境下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。
对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。
目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。
采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。
5、反胶团萃取法
反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。
反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。
这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。
三、根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
1、电泳
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。
聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。
它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。
等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。
利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。
在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。
三者区别：聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大
2、离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
四、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
1、亲和层析
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。
它通常只需一步处理即可
将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。
应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性以便设计出最好的分离条件。
该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。