qPCR实验从设计primer开始到 计算方法详例

本人在日本留学

虽然对于具体的原理不是特别理解，现把详细的实验real time PCR 的实验方法写出来让大家来参考。

第一步： primer 设计

Primer design:

1.Find out the mRNA of related gene, for example: Mus musculus

transgelin(Tagln) SM22a, mRNA

https:///nuccore/NM_011526.5

NCBI> Nucleotide> GenBank

2. open the website of Primer-Blast

https:///tools/primer-blast/

1.Enter accession, gi, or FASTA

NCBI Reference Sequnece:NM_011526.5 , range

2.

3.

Write the organism that you use for mice for homo sapiens, mice: Mus musculus (taxid:10090)

3.将设计的primer 序列交给公司合成就可以了。

提取mRNA

1.对于组织，如血管。

在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后，用粉碎机粉碎。大概20次/秒速度， 10秒每次，3次。

2.加入1ml Trizon, 常温静止30min

3.放于冰上，加入200ul chloroform，震荡混匀。 13000rpm, 4℃，离心10-

15min

4.取上清液，大概500-600ul

5.加入500ul 2-propronaol，震荡混匀，13000rpm, 4℃，离心10-15min。

（因小鼠组织太小，加入了4ul Dr.gene, precipitation）

6.去掉液体，加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水， PCR 用水)，离心

13000rpm, 4℃， 10-15min，重复操作2-3次。

7.去液体，干燥，加入PCR用水，溶解mRNA

8.测量RNA 含量。

9.定量RNA含量，保证样品中有650ng/ul

10.RT-RCR

5*buffer 4ul

dNTP 8ul

Radom primer 1ul

RTace 0.5ul

RPI 0.5ul

mRNA: 6ul

30℃， 10min； 42℃，60min；99℃， 5min；4℃，∞

完成后稀释样品5倍保存待用。

18s做参在保存用样品的基础上再稀释50倍。

11.Real-time PCR 每个样品做1次重复

SYBR qPCR mix: 7.5ul

ROX: 0.3ul

Primer F: 0.5025ul

Primer R: 0.5025ul

DW 4.695

cDNA: 1.75

HOT start: 1min , 95 ℃， 1cycle； Amp.2 step: 15s, 95℃；45s， 60℃，50cycle， Melt: 30s, 95℃。

完成后， ROX 做为reference，导出Ct值

最后结果Ct值计算方式例子

如：

得到的值为

计算2^ ΔΔct

此处KO3 肯定是个异常值，忽略不计

作 t-test， p=0.