漆酶高产菌株的筛选实验方案

漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。

漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。

糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。

由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。

通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。

漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。

由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。

漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。

造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。

环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。

分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。

实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

A 液和B 液混合，搅匀，于pH 计上调节至pH4.5。

（2） 0.5 mmol/L 的ABTS 溶液将一片ABTS 片剂（142 mg /片）用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250 mL ，配成1.0308 mmol/L 的ABTS 母液；再取48.5mL 的ABTS 母液，用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL 。

2 实验方法漆酶活性的测定方法：① 从三角瓶中取出适量酶液，离心取上清得到粗酶液，放于样品管中。

空白管加入1ml 液体的PDA 培养基。

② 每支离心管中加入5倍的柠檬酸－柠檬酸钠溶液稀释。

③ 将样品管，空白管，0.5mmol/LABTS 放在恒温水浴锅中，30℃预热10min 。

④ 加入2mL 预热好的酶液和0.5mmol/LABTS 溶液达到3mL 的反应液，于1cm比色皿中，启动反应5分钟，测定420nm 下吸光值随时间的变化值，每分钟读一次数。

在上述条件下，取吸光值变化的线性部分，定义每分钟转化1umol 的底物所需的酶量为一个酶活力单位，用U/mL 表示。

运用以下公式计算酶活。

漆酶酶活力U/mL =酶液稀释倍数⨯⨯⨯⨯∆⨯∆-62110V t εV OD 式中： ε----ABTS 在420nm 下吸光系数，为114106.3--∙⨯cm M ；t∆----1min；∆----1min内，吸光度OD的变化值；ODV1----酶反应中，反应液的总体积，3mL；V2 ----酶反应中，酶液的体积，2mL。

实验二高产漆酶菌株的酶学特性1 主要试剂的配制（1）0.2 mmol/L pH2.0—8.0的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A液和B液混合，搅匀，于pH计上分别调节至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。

（2）0.1—0.5 mmol/L的ABTS溶液将一片ABTS片剂（142 mg/片）用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250 mL，配成1.0308 mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液分别配制100 mL 的0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L的ABTS。

2 方法2.1 米氏常数（Km值）的测定在pH3.5的条件下，配制0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L不同ABTS底物浓度，30 ℃反应，测定漆酶反应的初速度，求出二者的倒数，以1/V对1/[S]作图，按照双倒数法（Lineweave－Burk法）作图，得到斜率为Km/V的直线，由此得到米氏常数Km值。

2.2 漆酶的最适反应pH和pH稳定性测定将漆酶分别加入到pH 2.0－pH 8.0缓冲液中，在30 ℃下，测定漆酶活性，检测漆酶的最适反应pH。

另外，将漆酶分别加入pH 2.0－pH 8.0缓冲液中，放置1h后，在30 ℃，最适反应pH条件下，测定漆酶活性，以开始时漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的pH稳定性。

2.3 漆酶的最适反应温度和热稳定性测定在漆酶最适反应pH条件下，分别在不同温度（20 ℃－80 ℃）下，测定漆酶活性，得出漆酶的最适反应温度。

将漆酶在pH 3.5环境中，分别在不同温度（20 ℃－80 ℃）下保温1 h，在最适反应温度、最适反应pH条件下测定漆酶活性，以保温前漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的热稳定性。

2.4 表面活性剂对漆酶活性的影响将漆酶置于含有1 mmol/L表面活性剂（Tris、EDTA、Tween80），pH 8.0缓冲液中，测定漆酶活性，以不添加表面活性剂漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，测定表面活性剂对漆酶活性的影响。

实验三漆酶的固定化一、实验原理壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。

壳聚糖分子中D－葡胺糖的-NH2可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合，从而壳聚糖－戊二醛－酶结构，即固定化酶。

本实验采用以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化漆酶。

二、材料、试剂和仪器1.材料：壳聚糖，漆酶2.试剂：1％的冰醋酸溶液、甲醛（37％）、1mol/L NaOH、0.8％的戊二醛（用磷酸缓冲液配制）、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）、2 mol/L NaOH1%冰醋酸溶液；2mol/L的NaOH溶液37%的甲醛溶液；0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液；0.8%的戊二醛溶液；0.1mol/L pH7.5的PBS磷酸缓冲液（内含0.5mol/L 的NaCL）0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.2）：Na2HPO4•12H2O，25.79g；NaH2PO4•12H2O，4.37g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

0.1mol/L的PBS磷酸缓冲液（pH7.5）：Na2HPO4•12H2O，30.08g；NaH2PO4•12H2O，4.37g，NaCL，29.22g用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

0.8%的戊二醛溶液：将25%的戊二醛用磷酸缓冲液配制而成，现配现用。

三、实验步骤1.壳聚糖凝胶颗粒的制备称取0.5g壳聚糖充分溶解于35mL1％的冰醋酸溶液中，加入3mL甲醛（37％）迅速混匀，在40℃水浴中静置保温60min，得到透明的凝胶，加少量蒸馏水将凝胶挤压破碎，倒出并在研钵中进一步破碎成适当大小的凝胶颗粒，接着在烧杯中使其悬浮于100mL蒸馏水中，不断地用2 mol/L的NaOH将悬浮液的pH值调至8.0，放置10min，然后用蒸馏水在抽滤漏斗上洗涤凝胶颗粒数次，抽去多余水分，备用。

2.壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒10g，加入40mL 0.8％的戊二醛，室温放置60min，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）洗涤凝胶颗粒3－4次，以除去多余的戊二醛，抽滤备用。

3.酶的固定化向上述的凝胶颗粒中加入15mL漆酶酶液，4℃下放置1h，中间搅动数次，而后用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）洗涤凝胶颗粒3－4次，以除去未固定的酶，即得固定化酶。

4. 酶活力的测定（1）溶液酶活力的测定（2）残留酶活力的测定（3）固定化酶活力的测定四、数据处理及计算固定化酶总活力数活力回收（％）＝×100％溶液酶总活力数固定化酶总活力数相对活力（％）＝×100％溶液酶总活力数－残留酶活力数实验四漆酶及固定化漆酶的应用一、漆酶对染料及果汁内酚类物质的降解溴甲酚绿二、染料最大吸收波长的确定将溴甲酚绿用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解，于UV－2450紫外可见分光光度计在200 nm－800 nm范围内进行扫描，确定溴甲酚绿的最大吸收波长λmax。

三、染料脱色率的确定将溴甲酚绿用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解，加入一定量的漆酶液，反应一段时间后，于最大吸收波长处测定吸光值。

按照以下公式计算染料的脱色率，比较不同脱色条件对染料酶解的影响。

染料脱色率R(%)=010 A AA×100％其中：A0为染料在最大吸收波长处的吸光值。

A1为反应体系加入漆酶以后在最大吸收波长处的吸光值。