抗植物病原菌活性菌株的筛选

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火棘抑菌内生真菌的筛选与拮抗植物病原菌作用研究

西北林学院学报２ｌ，２（）１～１０Ｏ２７５：１７２
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火棘抑茵内生真菌的筛选与拮抗植物病原菌作用研究
１２４火棘活性内生真菌的分子鉴定用ＣＡＢ．．Ｔ
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真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定

真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦【摘要】针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害,对柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等作物根际土壤进行拮抗菌筛选试验.结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株,其中有拮抗作用的34株,平皿拮抗效果较好的16株;再经复筛,得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55;对峙培养试验表明,Bs55菌株对12种常见病原真菌具有较强的抗菌活性,抑菌率最高达87.7%.拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖、抑菌谱广等特点,是具有较好利用前景的生物防治材料.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2010(041)007【总页数】4页(P675-678)【关键词】Bs55菌株;枯草芽孢杆菌;病原真菌;拮抗活性【作者】汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦【作者单位】广西大学农学院,南宁,530005;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,南宁,530007;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳,473061;广西大学农学院,南宁,530005;广西大学农学院,南宁,530005【正文语种】中文【中图分类】S476+.1真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主要病害［1］，给农业生产带来了严重危害。

土壤是各种微生物良好的栖息场所，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。

在生防菌株的筛选上，考虑到植物与微生物之间的相互作用关系，人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选，这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力［2］。

本研究针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害，从不同作物根际土壤中筛选拮抗菌，为开发广西微生物资源，筛选与环境相容性好的微生物农药奠定基础。

供试病原菌有柑橘炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solaniKühn）、玉米大斑病菌［Exserohilum turcicum （Pass.） Leonard ＆ Suggs］、玉米小斑病菌［Cochliobolus heterostrophus （Dreschl.）Dreschl.］、茉莉白绢病菌（Sclerotium rolfsiiSacc.）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.］、香蕉炭疽病菌［Colletotrichummusae（Berk.＆Curt）Arx］、冬瓜疫霉（Phytophthora drechsleriTucker）、龙眼链格孢黑斑病菌［Alternaria alternata （Fr.） Keissler］、香蕉大灰斑病菌［Curvularia lunata （Wakker）Boedijin］、香蕉叶缘枯斑病菌（Alternaria musaeBour.et Bat）、杨桃炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides（Penz.） Sacc.］等12种，均由广西农业科学院微生物研究所保存、提供。

商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选

商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant PathogensAbstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus. The results of antagonistic cultivation indicated that thirty-one strains of endophytic fungi, accounting for 86% of all the isolates, could inhibit one plant pathogens or more to some extent; and the inhibitory activity of six strains, seventeen percent of total isolates; was significant at least to one plant pathogens, with the anti-bacterial ratio higher than 75%. Antimicrobial activity of six strains’s culture filtrates were also detected and presented that the strains producing inhibition band in antagonistic cultivation also showed remarkable inhibitory activity to indicative pathogens in the test of culture filtrates. Among six screened strains, SBF02 and SBF06 showed remarkable inhibitory activity to Rhizoctonia solani Kühn, SBF08 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Botryosphae riadothidea, SBF11 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Fusarium solani(Mart.), and SBF08 and SBF32 showed remarkable inhibitory activities to Alternaria alternata and Fusarium avenaceum respectively.Key words: Scutellaria baicalensis Georgi; endophytic fungi; isolation; inhibitory activity内生真菌普遍存在于健康植物各种组织､器官和细胞间隙内,与宿主之间建立了紧密的生态关系,产生的次生代谢产物对提高植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力发挥着重要的作用｡因此,内生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的重要资源[1,2]｡尤其近年来随着人们对使用化学农药存在残留､容易引发抗性和再猖獗等隐患问题的深刻认识,从药用植物中分离筛选具有生防作用的内生菌以研发生物农药更是一个新兴的研究热点[3-5]｡黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物,主要以其根部入药,现代医学研究表明,黄芩含有40多种活性成分,具有抗氧化､抗过敏､抗菌､抗病毒等多方面的功效[6]｡目前有关黄芩内生真菌抗菌活性的研究主要集中在对医学病原菌的抑制方面,而对植物病原菌的抑制研究很少｡由于不同地理环境和气候条件下内生真菌有一定差异,陕西商洛地区具有从北温带向南暖湿带过渡的地理和气候特征,黄芩是驰名的五大商药之一,但对商洛黄芩内生真菌的研究尚未见报道｡本实验对商洛黄芩内生真菌进行了分离鉴定,并测定了内生真菌对5种植物病原菌的抑菌活性,以期获得具有良好抑菌活性的菌株,为寻找新型抑菌物质和研发生物农药提供依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料分离内生菌所用植物材料为黄芩,于2009年8月采自商洛香菊药源基地,取健康植株的根､茎､叶组织样品,装入保鲜袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存,2 d内样品处理完毕｡1.1.2 供试植物病原真菌选用以下5种植物病原菌为供试靶标菌:烟草赤星病菌(Alternaria alternata),苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea),棉立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn),茄腐皮病镰孢霉[Fusarium solani(Mart.)],草燕麦镰孢霉(Fusarium avenaceum)｡供试植物病原菌由陕西省微生物研究所提供｡1.1.3 培养基内生真菌的分离纯化以及靶标菌的培养采用PDA固体培养基;内生真菌的发酵用PDA液体培养基;内生菌的鉴定用查氏培养基和促孢培养基,促孢培养基配方如下:KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,淀粉0.2 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL, pH自然｡1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离与纯化内生真菌分离采用组织块分离法[7,8]｡将新鲜黄芩的根､茎､叶用自来水冲洗干净,分别切成约0.5 cm的小段(片),每个部位选标样32块,无菌条件下按下列程序进行表面消毒:75%乙醇(15~20 s)→无菌水(3~4次)→0.1%的升汞(3~5 min)→无菌水(4~5次),叶等幼嫩组织处理时间稍短｡再于无菌条件下将上述表面消毒的样品切成0.2 cm长的小段或0.2 cm×0.2 cm的小片接种于含0.04%氯霉素的PDA平板上,置28 ℃恒温培养5 d 左右｡待组织块断面边缘长出菌丝后,根据菌落形态和颜色等的不同用接种针挑取尖端菌丝分别移至新的PDA培养基上,反复转接纯化,得到纯培养菌株,4 ℃保藏备用｡为了检验对材料表面消毒是否彻底,以消毒后不做任何切割的样品作为对照,于相同条件下培养,如对照平板无菌丝长出则证明表面消毒灭菌彻底,分离的真菌来自植物组织内部,否则分离结果无效｡1.2.2 内生真菌的形态观察与初步鉴定挑取在PDA培养基上纯化好的菌株尖端菌丝接种于查氏培养基和产孢培养基上,培养一段时间后观察菌落､菌丝体和孢子的形态特征,参考有关文献将分离的内生真菌鉴定到属[9-11]｡以点植培养法进行菌落观察和常规镜检:用接种针从斜面上取少量孢子,点植于平板上适当的位置,倒置平板于恒温箱中, 28 ℃培养4､7､10 d,观察菌落特征｡取少量菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色,进行常规镜检｡以插片法观察培养基内和气生菌丝:将真菌接种到平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上｡观察时轻轻取出盖玻片置于载玻片上,直接观察｡以印片法观察孢子及菌丝体形态:将要观察的菌落先印在盖玻片上,放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察｡根据鉴定结果,计算内生真菌的分离率｡分离率=某一指定类型内生真菌株数/分离样品组织块总数×100%1.2.3 拮抗真菌的初步筛选拮抗真菌初步筛选采用对峙培养法[6,11]:在无菌条件下将内生真菌和供试病原菌活化好,用打孔器制成直径为0.5 cm的菌饼分别移至PDA平板上,二者相距2.5 cm,同时以只接病原菌的平板作对照,处理和对照均设3次重复,置于28 ℃下恒温避光培养｡观察记录对峙培养中病原菌菌落的生长和抑菌现象,测量菌丝扩展半径,根据抑菌率初步筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌｡抑制率=(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/对照菌落半径×100%1.2.4 初筛拮抗真菌培养滤液活性的测定1)摇瓶培养:将分离的拮抗作用较好的内生真菌在斜面培养基上活化,待生长旺盛后,在无菌条件下用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打下10块菌饼,并用接种针挑取接种至含200 mL PDA液体培养基的500 mL锥形瓶中,28 ℃,120 r/min 恒温摇床振荡培养10 d后,无菌条件下过滤除去菌丝,滤液用于代谢产物活性的测定[12]｡2)活性测定:按生长速率法,取20 mL滤液与150 mL熔化的PDA培养基(50~60 ℃)混匀制成平板, 接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼于平板上,以不加滤液的PDA平板作对照,每个处理重复3次, 28 ℃下静置培养5 d, 测量菌落直径, 同时观察对照情况,计算抑制百分率｡2 结果与分析2.1 商洛黄芩内生真菌的分离与鉴定结果从8月份采集的商洛黄芩的96个组织块中分离到36株内生真菌,总分离率为37.50%,其中根､茎､叶各分离到14､10､12株,分离率分别为43.75%､31.25%､37.50%｡分离菌株经鉴定隶属于12个属,根､茎､叶分别有8､4､5属,优势属为链格孢属,有12株,占总分离菌的33.33%(表1)｡总体看来,商洛黄芩中分布的内生真菌比较丰富,不同组织部位内生真菌的数量相差不大,但属种分布存在明显差异｡2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用筛选结果对峙培养测试表明,商洛黄芩中存在丰富的抗菌活性菌株,分离的36株内生真菌中有31株对5种植物病原菌中至少1种有不同程度的拮抗作用,占总分离真菌的86.11%(表2)｡在活性菌株中,对苹果干腐病菌有抑制作用的菌株最多,有25株,占活性菌株总数的80.65%,且14株菌抑菌率在60%以上,其中从叶部分离到的菌株SBF27的抑菌率达82.36%｡对茄腐皮病镰孢霉､烟草赤星病菌､棉立枯病菌和草燕麦镰孢霉抑菌率在60%以上的菌株分别为12､10､8和7株,综合分析得知,36株分离菌中对至少1种病原菌的抑菌率在60%以上的菌株有21株,占总菌株数的58.33%｡对峙试验显示不同内生真菌对同一病原菌的抑制效果差异较大,以对苹果干腐病菌的抑制为例,SBF23对它的抑制率是15.31%,而SBF27对它的抑菌率达82.36%;同一内生真菌对不同病原菌的抑制程度也不相同,如菌株SBF02､SBF08和SBF32对5种病原菌都有较强的抑菌率,而其他菌株只对特定的病原菌产生较强的拮抗效应,拮抗作用因病原菌的不同表现出较大的差异｡可见内生真菌对病原真菌的拮抗作用具有一定选择性｡此外,从对峙试验中发现,内生菌对病原菌的抑制作用也有多种表现形式｡有的内生菌对病原菌产生抑菌带,在显微镜下可以看到病原菌菌丝出现萎缩､断裂p 2.3 初筛菌株培养滤液的活性测定结果测定结果表明,初筛得到的6株菌的培养滤液对5种病原真菌均有不同程度的抑制作用(表3),其中SBF02和SBF06对棉立枯病菌,SBF08和SBF27对苹果干腐病菌,SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉,SBF08和SBF32分别对烟草赤星菌和草燕麦镰孢霉的抑制率都在60%以上,抑菌活性最强的是SBF27对苹果干腐病菌的抑制,抑制率为71.37%｡观察发现,培养滤液抑菌活性较高的一般都使病原菌菌落长势变慢,气生菌丝减少,显微镜下可见菌丝变短,末端膨大且少有分枝｡而对照菌丝生长正常,菌丝粗壮,分枝较多且有大量分生孢子产生｡通过比较培养滤液抑菌活性测定和对峙培养的结果发现,培养滤液抑菌活性较高的菌株原来在对峙培养中抑菌率也高且有抑菌带产生,如菌株SBF08对苹果干腐病菌的抑制等,说明这些菌株对相应病原菌的抑菌活性物质是分泌到菌丝外的｡但同时也发现,有些在对峙培养中抑菌率较高但无抑菌带产生的菌株,其培养滤液对相应病原菌的抑菌活性却比较低,如菌株SBF11对苹果干腐病菌的抑制等｡这说明它们对相应病原菌的抑制可能是借菌丝的快速生长优势,与病原菌争夺空间和营养而产生抑菌作用的｡3 结论与讨论对商洛黄芩内生菌的分离鉴定和抗植物病原菌活性测定结果表明,商洛黄芩内生菌具有丰富的多样性,属种分布在根､茎､叶中存在明显差异,活性菌株的比例也较高;实验显示隶属于不同属的菌株对同一病原菌表现出不同程度的拮抗活性,而同一属的菌株其抗菌范围以及抗菌活性既相似又有差异｡黄芩内生菌的多样性和抗菌活性的选择性表明其可以作为生防农药开发的重要资源｡实验筛选出了6株高活性的菌株,其中,SBF02(镰刀菌属)和SBF06(青霉属)对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF27(链格孢属)对苹果干腐病菌抑制效果较好;SBF11(头孢霉属)和SBF27(链格孢属)对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF32(链格孢属)分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡这些菌株的种的鉴定有待进一步研究,如用分子标记方法进行聚类分析等｡内生菌对病原菌抑制作用有各种表现形式,在本实验中,对峙试验产生抑菌带的菌株其培养滤液的抑菌活性也较高,病原菌在活性物质的作用下,菌落萎缩,菌丝断裂､消解｡关于活性物质的具体成分､性质和对病原菌的作用靶点需要进一步提取和分析研究｡内生真菌在黄芩中属种分布的组织差异性可能是由于不同组织的结构､营养､代谢特征等内部环境有别,不同的内生菌在黄芩生长过程中承担的作用不同,因而使内生菌在不同的部位定植｡值得注意的是,正是由于内生菌和植物建立了密切的生态关系,一旦从寄主植物中分离出来后,自身的一些特性也会随之改变[13]｡如在试验中经常会发现,有些活性菌株经多次转接培养或长时间保存后出现菌种退化､抗菌活性降低等现象,这可能是人工培养基成分和保存条件与植物组织的差异所致｡因此,还应对活性菌株的生理生化特性进行测定,以确定内生菌离体培养､保存以及产生活性物质的最适条件,为生防农药开发奠定基础｡参考文献:[1] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.[2] 石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2400.[3] 刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.[4] 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植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究

标题：植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究一、引言植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究，是近年来植物保护领域的热门研究方向之一。

本文将从深度和广度两方面对这一主题展开全面评估，以期帮助读者更全面、深入地了解该领域的相关知识和研究进展。

二、植物病原真菌拮抗菌筛选1. 筛选方法植物病原真菌拮抗菌的筛选方法多样，包括体外筛选法、田间筛选法、植物病原真菌生物学特性的筛选法等。

其中，体外筛选法是目前应用较为广泛的一种方法。

2. 筛选指标在进行拮抗菌筛选时，需根据具体情况确定筛选指标，通常包括抑菌圈直径、拮抗活性指数、有效抑制率等。

通过严格的实验设计和数据分析，可筛选出具有良好拮抗活性的菌株。

三、植物病原真菌拮抗菌鉴定1. 鉴定方法植物病原真菌拮抗菌的鉴定方法主要包括生理生化鉴定、分子生物学鉴定和形态学鉴定等。

这些方法可以相互印证，提高鉴定结果的准确性和可靠性。

2. 鉴定技术近年来，随着生物技术的发展，分子生物学鉴定技术在植物病原真菌拮抗菌鉴定中的应用日益广泛，其高效、快速的特点为鉴定工作带来了便利。

四、植物病原真菌拮抗菌抑菌机理研究1. 抑菌机理植物病原真菌拮抗菌的抑菌机理通常包括竞争性排除、产生抑菌物质、拮抗菌调控宿主免疫反应等。

深入研究拮抗菌的抑菌机理有助于更好地理解其生物学特性和应用潜力。

2. 抑菌物质拮抗菌产生的抑菌物质在植物病原真菌的生长和发育中发挥着重要作用，因此对其抑菌物质的研究具有重要意义。

通过分离、纯化和结构鉴定，可为该领域的进一步研究和应用奠定基础。

五、个人观点与总结植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究，是一个既具有理论意义又具有应用价值的领域。

通过对这一主题的深度研究，我们可以更好地理解拮抗菌的生物学特性和抑菌机理，为植物保护和农业生产提供更多的技术支持。

在撰写本文时，笔者深入研究了植物病原真菌拮抗菌的相关文献和研究成果，不仅对筛选、鉴定和抑菌机理有了更深入的理解，也为未来的研究和实践积累了宝贵的经验。

植物病原真菌拮抗细菌的筛选鉴定及活性成分分析

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉ８８）ａｇａｉｎｓｔＴｅｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎｓ／Ｒｅｎ
Ｊｉａｎｊｕｎ（ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｐ，Ｒ．Ｃｈｉｎａ）；ＳｈｉＧｕａｎｇｌｕ，ＧａｐＭｅｉｊｕａｎ（ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
褐腐病菌的抑制率较大，分别为８７．３１％和８０．１５％（Ｐ＜０．０５）；对棉花红腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制率低于４０％（Ｐ＜Ｏ．０５）。ＲＮ一６１与枯草芽孢杆菌相似度最高，为９９％，确定其为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｋＲＮ一６１），ＮＣＢＩ登录号为ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＫＣ８４０６６８。菌株ＲＮ一８８与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｚ ∞ ｓｃｅ瑚Ｆ１１３等相似度为９９％，确定其为假单胞菌属的荧光假单胞杆菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｓＲＮ一８８）。对不同盐浓度提取的菌株ＲＮ一６１抗茵蛋白活性研究发现，效果最好的是饱和度为８０％的（ＮＨ），Ｓ０溶液提取的蛋白。蛋白原液对桃褐腐病菌的抑茵活性最强，９６ｈ后的病原真菌直径为２９．０ｍｍ（Ｐ＜０．０５）。关键词拮抗细菌；枯草芽孢杆菌：荧光假单胞菌杆菌；抑菌蛋白分类号￥７６３．１３

植物病原真菌拮抗放线茵的筛选

ａＡｅｎｒｏｎ。ｉｅＵ，ｋｒｉＣｒｌｉｆａ，ｒａｉａｅｎｔＦｌａｕａＥｓｒｉｍｔｒｃｍｗｒｐｃｅｐａｉｉｔｓｒａａｌｉＧｂｒａｉｏｕｖａａｕｔＡｅｎｒｔａ，ｕｉｆｌ，ｘｅｏｌｃｕｅｉｄｕｄｃｏｈｉＳａｂｅｕ，ｕｒｎａｈａｌｒａｖｖｈｕｕｉｅｋｓｎａｒ
密学的发展，放线菌又成为新微生物药物生
每年给粮食生产造成巨大的损失。目前对植物病害的防治普遍采用化学农药，而化学农药对非靶标生物的毒害、环境的污染、害物抗药性的问题至今仍难以解决，因而生物防治
方法被认为是一条有效的途径。放线菌是一类与人类关系
接种量接人发酵培养基（淀粉５．ｇｇ花生饼粉２．ｇｇ０ｋ，０／３ｋ，０，
（Ｈ４Ｓ４．ｇｋ，ａＯ４０ｇｋ，Ｈ７２，然后置于２Ｎ）Ｏ０／ｇＣＣ３．／ｇｐ．）２４８℃ 、
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海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选

海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选
海南粗榧是一种传统药用植物，而内生真菌则是在植物体内生长繁殖的一类微生物。

筛选海南粗榧内生真菌中的抗肿瘤活性菌株可以是一项有潜力的研究工作。

以下是筛选这些菌株的一般步骤和方法：
1. 采集样本：首先，需要采集海南粗榧的根、茎、叶等不同部位的植物样本作为研究对象。

2. 分离内生真菌：将采集到的植物样本进行表面消毒处理后，将其不同的组织进行分离，例如通过切碎、挤压等方法，然后将分离得到的组织接种于适宜的培养基上，培养出内生真菌。

3. 纯化菌株：从培养基上选取单个菌落，进行纯化，即通过反复传代分离，确保获得纯种的内生真菌菌株。

4. 抗肿瘤活性筛选：使用不同的抗肿瘤活性评价方法，如细胞毒性测试、抑制肿瘤细胞增殖测试等，对分离得到的内生真菌菌株进行筛选。

可以选择一系列肿瘤细胞系，如肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞等，进行体外实验评估菌株的抗肿瘤活性水平。

5. 活性成分分离与鉴定：对于表现出较高抗肿瘤活性的菌株，可以进行化学成分的分离和鉴定工作，以确定其具体的抗肿瘤活性成分。

需要注意的是，这个过程是一个复杂的研究过程，需要有相关的实验室设备和技术，并且需要进行大量的前期实验和数据分析。

此外，筛选出的抗肿瘤活性菌株的进一步研究还需要进行动物实验和临床研究，以验证其安全性和有效性。

因此，这是一个需要持续努力和长期投入的科研工作。

链格孢菌抗植物病原真菌活性筛选

ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｎａｔｕｒａｌｄｒｕｇｓ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉ０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３７０４．２０１３．０３．００６
链格孢菌抗植物病原真菌活性筛选
周稚凡，黄伟，谢津，李靖
（西南林业大学生命科学学院，云南昆明６５０２２４）
ＺＨＯＵＺｈｉ－ｆａｎ，ＨＵＡＮＧＷｅｉ，ＸＩＥＪｉｎ，ＬＩＪｉｎｇ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
ｇｒｉｓｅａａｄＴｎｙｐｈｕｌａｉｎｃａｒｎａｔｅ，ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｆｌｔｅｒｐａｐｅｒ￣Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ４ｂｒｏａｄ－ｓｅｃｐｔｒｕｍｓｔｒａｉｎｓｏｆＡｌｔｅｒｎａｒｉａｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｔｈｏｓｅｔｅｎｐｌａｔｎｐａｔｈｏｇｅｉｃｎｆｕｎｇｉ．Ｏｆｔｈｅｍ，ｔｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ

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第三章抗植物病原菌活性菌株的筛选43第三章　抗植物病原菌活性菌株的筛选　
对从芹菜和油菜中分离得到的215株内生菌包括34株内生放线菌进行拮
抗植物病原菌的体外活性筛选
第一节活性菌株的筛选
１．１材料　
１．１．１待测菌　
从油菜和芹菜中分离的215株内生菌纯化后使用
直喙镰孢菌Fusarium orthoceras
由中国科学院沈阳应用生态研究所惠赠
１．１．３培养基　
改良沙氏培养基
１．２方法　
１．２．１菌块活性的检测　
采用菌块对峙培养测定法
接种于改良沙氏培养基的培养皿中央下培养24 h
¶ÔÕÕ²»½ÓÉ¸Ñ¡¾ú下培养72h
Ñ¡ÔñÞ×¿¹×÷ÓÃÃ÷ÏÔµÄ¾úÖê½øÐÐ¸´É¸
蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探
44
初筛有活性的菌株用改良沙氏液体培养基28·¢½ÍÒº5000rpm离心10minÖØ¸´3次ｍ的滤膜过滤
下保存
冷却凝固后
28ÒÔÖ±½ÓÅàÑøµÄ²¡Ô-¾ú×÷Îª¶ÔÕÕ
ÒÔÈçÏÂ¹«Ê½¼ÆËãÏà¶ÔÒÖÖÆÂÊÔÚÊµÑéÊÒµÄÌåÍâ»îÐÔÉ¸Ñ¡ÖÐ时
初始
对照组菌块直径
对于215株内生菌包括34株放线菌进行了菌块活性的初筛其中放线菌为8株
而从放线菌中筛选到活性菌株的比例为23.5可见从放线菌中发现生物活性的概率远高于其它微生物
１
ＹＣＥＤ　３　
ＹＣＥＤ　１５Ｂ＊
ＹＣＥＤ　１６Ｂ＊
ＹＣＥＤ　２４Ｂ＊
第三章抗植物病原菌活性菌株的筛选45
ＣＨＳＨ　１２Ｂ　
ＣＨＳＨ　１９Ａ＊
ＣＨＳＨ　２５Ｂ
ＣＨＳＨ　３４＊
ＣＨＳＨ　３８＊
ＹＩＭ１８　
¾úÖê±àºÅÖÐ´øÓÐ*标志的为放线菌代表有活性代表没有活性　
１．３．２发酵液活性检测　
发酵液活性复筛的实验结果如图３当相对抑制率小于３０
图中不做表示
从图３放线菌ＣＨＳＨ１９Ａ　发酵液拮抗立枯丝核菌的活性最高
ＹＣＥＤ７ＣＨＳＨ１９ＢＣＨＳＨ３４和ＣＨＳＨ３５６
对三种病原真菌均有拮抗活性　部分菌株固体培养时有抑制活性如ＣＨＳＨ３２
对三种病原菌ＹＣＥＤ３
其原因可能有产生抗生
素的同时产生一种分解抗生素的物质抗生素的产生
与琼脂中含有的某些微量物质有关
发酵液显示出活性ＹＩＭ１６
和ＹＩＭ１８对立枯丝核菌ＣＨＳＨ１８和ＣＨＳＨ１２Ｂ对苹果黑腐皮
壳虽然比较简便
造成漏筛
也就是前面使用的菌块
活性和发酵液活性适于大量筛选
液体发酵可利用发酵液进行更多的试验
蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探
46
性电泳　
固体发酵与液体发酵有时有一定的差别
而液体发酵时无抗菌活性他们从土壤分离到６５００株放线菌这些活性菌株再用液体发酵时而有２５株在液体发酵时无抗菌活性
初筛时在琼脂培养基上产生的抗生素与液体培养产生的抗生素可能不是同一抗生素
可以用这几种培养液或者某些提取物重新检测［１］
菌株编号中带*标志的为放线菌
图3
第三章抗植物病原菌活性菌株的筛选47
第二节活性菌株的染色和显微观察
对显示出抑制植物病原真菌活性的菌株
２．１材料　
第一节筛选出的２０株活性菌株
干燥
２．２．２染色　
用草酸铵结晶紫染液染色1min
２．２．３媒染　
滴加革兰氏碘液冲去残水用水冲去碘液
滴加95²¢ÇáÇáÒ¡¶¯ÔØÆ¬
Ô¼0.5min立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干
必须严格掌握乙醇脱色的程度脱色不够时
阴性菌被误认为阳性菌
水洗
以金黄色葡萄球菌作为阳性菌对
照细胞呈紫色的是革兰氏阳性菌
蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探
48
染液配法参见附录
２．３．结果和讨论　
在２０株活性菌株中占４０细菌为１２株
放线菌是生物活性菌株的极好来源
表３活性菌株的基本特征　
菌株　来源　革兰氏染色结果　形状　大小ｍ
５　ＹＣＥＤ　３　芹菜叶　革兰氏阴性菌　杆菌　１ｘ２　
ＹＣＥＤ　７　芹菜叶　革兰氏阴性菌　球菌　０
ＣＨＳＨ３５因为菌种退化没有染色观察
第三章抗植物病原菌活性菌株的筛选49
第三节　小结　
１．　筛选出２０株内生菌　２．　６株内生菌　３．　活性细菌以革兰氏阴性菌为主
参考文献　
［１］．吴剑波主编
黄仪秀主编．微生物学实验教程．北京。