第五章 目的基因的获取

人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 粘性末端 ③ 同聚物加尾
末端转移酶
CCC
粘性末端
CCC
4. 基因组文库的大小 一个文库要包含99%的基因组DNA时所 需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1-f)
ln以e为底 的对数
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）
N：所需的重组载体数（克隆数）
三、文库的查询（screening） 用目的基因探针与文库中的重组 载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 测序分析 电泳后杂交 放射自显影
第四节 目的基因的分离和扩增
一、从mRNA分离目的基因
富集特定基因的mRNA或cDNA模板。 1. 探针柱分离特异mRNA 根据已知的基因序列合成探针，结合 到纤维素柱上，用来分离纯化该基因 的mRNA。
3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA 反转录酶 3’ mRNA cDNA第一链 碱 或RNaseH 5’ 引物 cDNA第一链 5’ 5’ 3’
3’
③ cDNA第二链合成 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯 回来的双链发卡结构（机理不明），可成 为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚 合酶合成第二链DNA.。 5’ cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Sau 3A
(同尾酶)
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断 裂成约300bp的随机片段。
（2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片段。
f: 插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因 组DNA的百分数 N：所需的重组载体数（克隆数）
ln (1-p) ln (1-99%) N= ln (1-f) = ln (1-f) = 4.61× G f
G N= 4.61× f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片段的平均长度如果是1.7×104 bp
五价
三价
如此经过多次循环，直到合成所需长度 为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上 洗脱下来，最后除去NH4OH ，在真空 中抽干，样品即可溶于适量的水中进行 纯化分析。
要注意的问题:合成方向3’ → 5’ 核苷酸单体的磷酸基团在3’端 亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。
二、 化学合成DNA片段的组装 化学合成的DNA片段一般在200bp以内。 1. 互补连接法 （1）互补配对 预先设计合成的片段之间都有互补 区域，不同片段之间的互补区域能 形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移酶 CCC CCC
6. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= 1 ln (1- n)
p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） 1 n : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA 占细胞整个mRNA的比例
3. cDNA文库的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。
4. 构建cDNA文库的一般步骤
（1）总RNA（total RNA）提取
提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化 ① 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 ② mRNA的分离纯化 Column（柱） 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
用Oligo dT（或随机引物）作引物，合 成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 5’
Oligo dT引物
② 降解mRNA模板
用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA。
3’ 5’ 引物
3’ 5’ 引物 3’ mRNA 5’ 3’ 5’
mRNA cDNA 反转录酶 mRNA cDNA第一链 RNaseH
DNA 聚合酶mRNA
DNA 聚合酶
mRNA
cDNA第一链 去引物 DNA ligase cDNA第二链 cDNA第一链
5.cDNA与载体连接： 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与 载体连接，转入受体菌。
5’ 3’
④去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会 导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
妙用RNaseH
这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的 mRNA，并将其降解成许多小片段。 小片段正好成为DNA聚合酶的引物， 用来合成冈崎片段。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用 DNA连接酶连成一整条DNA链。
gene
二、随机片段化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶
平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。 2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
起始脱氧单核苷酸
加入的脱氧单核苷酸
② 带保护的单核苷酸连接
带5’保护的单 核苷酸与带3’ 保护的另一个 单核苷酸以磷 酸二酯键连接 起来
③ 用酸或碱的脱保护
80%乙酸
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。
9 3 × 10 G = 4.61× 5 = 8.1 × 10 4 N= 4.61× f 1.7×10
二、 cDNA文库的构建
1. cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 3’ mRNA 5’ 5’ 引物 cDNA 反转录酶 3’ 2. cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进 行保存和扩增，称cDNA文库。
2. 构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构 建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 （1）对载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片段数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片段长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。 ① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
② 酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片段。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。 ① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。 ②人工接头法（adapter）
5’
引物
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点
1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片段。
5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔 接物（Linker）序列。 衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定 限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链 DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性 末端某种酶切所产生的粘性末端）。
用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端 带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶
使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法 预先设计的片段之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片段延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。 3’ Klenow片段 5’ T4DNA连接酶 5’ 3’
AATTC G
GAATTC CTTAAG
EcoRI Adaptor
EcoRI Linker DNA合成仪
第三节 目的基因的保存和扩增
一、基因文库的构建 1. 基因文库（gene library） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片段，并将所有这些片段 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因文库。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。
固相磷酸三酯合成过程
C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
结果是全保护的DNA：5’ DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲 基 ), 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片段。
酶切
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I
Total mRNA 过柱
纤 维 柱
探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA
纤 维 柱
探针DNA
特异 探针DNA mRNA
探针DNA
探针DNA
洗脱
与探针碱基互补的mRNA结合 到柱上，其它mRNA流走。
RT-PCR
2. mRNA消解杂交
原理： 羟基磷灰石柱 （Hydroxylapatite column） 结合DNA-RNA或DNA-DNA双链， 不结合单链DNA。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。 一、目前常用的方法
磷酸二酯法、
亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、
固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的3’端P和5’端–OH 保证合成反应的定向进行。
目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成 仪上自动进行的，DNA自动合成已采用 的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法， 由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合 成效率高和副反应极少等优点，已经在 自动合成仪被广泛采用。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4— 二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单 体1上的5’—OH。
Hale Waihona Puke Baidu
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰 上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基 进行反应。
(3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的 核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯 键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。 (4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核 苷酸单体1 中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终 止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机 会。 (5)氧化反应 形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷 酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转 化为磷酸三酯，其中磷为5价。