2+蛋白质结构测定
测定蛋白质三维空间结构准确的方法
测定蛋白质三维空间结构准确的方法蛋白质是生物体中最重要的分子之一，其功能与其三维空间结构密切相关。
准确测定蛋白质的三维空间结构对于理解其功能和研究相关疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的方法来测定蛋白质的三维空间结构。
一、X射线晶体学X射线晶体学是目前应用最广泛的测定蛋白质三维结构的方法之一。
该方法利用X射线的衍射原理来测定晶体的原子结构。
首先，通过结晶技术获得蛋白质的晶体样品，然后将晶体置于X射线束中进行衍射。
通过测量衍射图样的强度和角度，利用数学方法可以计算出晶体中原子的位置，从而得到蛋白质的三维结构。
尽管X射线晶体学是一种非常强大的方法，但其应用也存在一些限制。
首先，需要获得高质量的蛋白质晶体，这对于某些蛋白质来说是非常困难的。
其次，X射线晶体学只能测定静态的蛋白质结构，不能揭示蛋白质在不同功能状态下的构象变化。
二、核磁共振（NMR）核磁共振是另一种常用的测定蛋白质结构的方法。
该方法利用核磁共振现象来研究分子的结构和动力学。
在蛋白质的NMR实验中，通过对蛋白质溶液进行一系列核磁共振实验，可以获得蛋白质的二维或三维核磁共振谱图。
通过解析谱图，可以得到蛋白质的构象信息。
与X射线晶体学相比，核磁共振具有一些优势。
首先，核磁共振可以在溶液中测定蛋白质的结构，不需要获得晶体样品。
其次，核磁共振可以揭示蛋白质在溶液中的动态结构，可以研究蛋白质的构象变化和相互作用。
然而，核磁共振也存在一些限制。
首先，对于大型蛋白质来说，获得高质量的核磁共振谱图是非常困难的。
其次，核磁共振的分辨率相对较低，无法获得高分辨率的蛋白质结构。
三、电子显微镜（EM）电子显微镜是一种可以直接观察生物大分子的高分辨率成像技术。
近年来，随着技术的发展，电子显微镜在测定蛋白质结构方面取得了显著的进展。
通过电子显微镜观察蛋白质的投影图像或三维密度图像，可以得到蛋白质的结构信息。
与X射线晶体学和核磁共振相比，电子显微镜具有一些独特的优势。
蛋白质结构测定实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质结构测定的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质一级结构和三维结构的测定方法。
3. 了解蛋白质结构测定在生物学研究中的应用。
二、实验原理蛋白质是生命活动中的重要分子，其结构决定了其功能。
蛋白质结构测定是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
蛋白质结构测定主要包括一级结构测定和三维结构测定。
1. 蛋白质一级结构测定：蛋白质一级结构是指氨基酸的排列顺序。
测定蛋白质一级结构的方法有化学裂解法、蛋白酶水解法、高效液相色谱法等。
2. 蛋白质三维结构测定：蛋白质三维结构是指蛋白质分子在空间中的形态。
测定蛋白质三维结构的方法有X射线晶体衍射法、核磁共振法、冷冻电镜法等。
三、实验材料1. 蛋白质样品：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）等。
2. 试剂：硫酸铵、氯化钠、丙酮、乙腈等。
3. 仪器：高效液相色谱仪、核磁共振仪、X射线晶体衍射仪、冷冻电镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质一级结构测定（1）将蛋白质样品进行化学裂解，得到多肽片段。
（2）使用高效液相色谱仪对多肽片段进行分离，得到单个多肽。
（3）对单个多肽进行质谱分析，得到氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定（1）将蛋白质样品进行X射线晶体衍射实验，得到蛋白质晶体。
（2）对蛋白质晶体进行X射线衍射，得到衍射图谱。
（3）根据衍射图谱，计算蛋白质分子的三维结构。
3. 蛋白质结构分析（1）使用核磁共振仪对蛋白质样品进行NMR实验，得到蛋白质分子的三维结构。
（2）将NMR实验结果与X射线晶体衍射结果进行对比，验证蛋白质结构。
五、实验结果与分析1. 蛋白质一级结构测定通过高效液相色谱仪和质谱分析，成功测定了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定通过X射线晶体衍射实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
3. 蛋白质结构分析通过NMR实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
与X射线晶体衍射结果进行对比，验证了蛋白质结构。
蛋白质二级结构预测方法
蛋白质二级结构的预测方法初探【摘要】提出了研究蛋白质二级结构预测的意义，介绍近三十多年来蛋白质二级结构预测的方法分类，分别列举出各类典型蛋白质二级结构预测方法的具体实现过程并最终对预测结果进行比较。
【关键词】蛋白质二级结构多序列比对法神经网络蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。
蛋白质分子并非如一级结构那样是展开的“线状”，而是出于更高级的水平，多肽链主链中各原子在各局部的空间排布如何，是蛋白质二级结构主要研究的问题。
蛋白质的功能主要由特定的三维结构所决定，因此，为了了解蛋白质功能，人们迫切需要确定蛋白质的三维结构。
目前测定蛋白质结构的方法有x－光线衍射、核磁共振以及电子显微镜方法。
所有这些方法都是耗时的，并且受到较多限制，如需纯净蛋白、小蛋白等。
这样结构测定技术远不能赶上每天数以千计的测序速度。
为了缩小结构与已知序列之间的差距，发展理论的蛋白质结构预测方法势在必行。
因此，在认为蛋白质的三维结构式由它的序列和环境所决定的情况下，促使人们利用蛋白质二级结构来预测其三维结构。
蛋白质二级结构预测问题已成为生物信息学的经典问题之一。
蛋白质二级结构预测已经有三十多年的历史，各种不同的预测方法可以分为三类：统计学方法、多重序列比对法、神经网络方法。
本文将例举三种典型性的预测方法进行阐述和比较。
chou—fasman是一种典型的统计学预测方法，基于15个已知构象的蛋白质和2473个氨基酸确定蛋白质二级结构。
它的经验规则是使用进行二级结构预测：寻找折叠核：从6个残基中找到了4个(hb或hb)便可以确定一个b折叠形成核，相反当(bb或bb)出现概率大于1／3时便不能确定；沿着多肽链向两个方向延伸b折叠形成核，直到遇到连续几个b折叠破坏者时才终止。
b折叠破坏者包括b4，b3i等等；边界调整：glu很少出现在b区，pro也不会出现在b折叠中，带点荷氨基酸残基都很少出现在两端。
trp频繁出现在n-末端。
蛋白质结构分析方法
蛋白质结构分析方法：X射线晶体衍射分析和核磁共振x 射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。
多维核磁共振波谱技术已成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维结构的唯一有效手段。
NM R技术最大的优点不在于它的分辨率，而在于它能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。
蛋白质的序列结构测定:1.到目前为止，最经典的蛋白质的氨基酸序列分析方法是，sarI等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白质序列仪，及后来发展的固相和气相的蛋白质序列分析仪。
2.质谱：早期的质谱电离的方式主要是电子轰击电离(EI)，它要求样品的挥发性好，一般与气相色谱联用。
但使用G C／M S分析，肽的长度受到限制，只能分析小的肽段。
近年来，在离子化的技术及仪器方面取得了突破性进展，使得质谱所能测定的分子量的范围大大超出了10k u。
因此，软离子化技术、基质辅助的激光解吸／离子化(MALDI)和电喷雾离子化(E SI)显得尤为有前途。
通过串联质谱技术(MS／MS)和源后衰减基质辅助的激光解吸／离子化(PSD—MAIDI—MS)，人们就可以从质谱分析中获得肽及蛋白质的结构信息。
蛋白质三维结构的研究：1.X射线单晶衍射分析2.核磁共振分析3.蛋白质的二维晶体与三级重构：蛋白质二维结晶及其电子晶体学的结构分析是目前结构生物学最活跃的领域之一。
此法既适用于水溶性蛋白质，也适用于脂溶性膜蛋白的研究。
电子晶体学的结构分析源于早期的电子衍射分析。
与X射线衍射方法类似，电子衍射数据的实验分析得到的只是结构因子的振幅部分，丢掉了相位信息。
但从剑桥MRC分子生物学实验室的Klug和DeRo sier建立了三维重构的方法开始，电子晶体学才真正发展成为一种独立的空间结构的分析方法，并从传统的X射线晶体学中脱胎出来。
所谓电镜图像的三维重构是指由样品的一个或多个投影图得到样品中各成分之间的三维关系。
蛋白质的二级结构测定
百泰派克生物科技
蛋白质的二级结构测定
蛋白质的二级结构是指蛋白质主链折叠产生的由氢键维系的有规则的构象，包括三种最主要的结构原件，α螺旋（H）、β折叠子（E）和无规则卷曲（C）。
蛋白质的二级结构是联系一级结构和三级结构的桥梁，所以二级结构的预测可为三级结构预测提供很好的起始条件。
蛋白质二级结构检测的基本原理就是通过对结构已经测定的蛋白质序列和其二级结构对应关系的统计分析，归纳出一些预测规则，用于待测蛋白的二级结构预测。
目前已开发的蛋白质二级结构测定方法大致可分为3代。
第一代测定方法主要特点是采用简单的统计方法对单个残基形成的二级结构进行分析，代表性的方法有Chou-Fasman；第二代测定方法主要特点是采用更复杂的统计方法对单个残基形成的二级结构进行预测，同时对其周围氨基酸残基形成二级结构的倾向性进行分析，代表性的方法如GORIII；第三代测定方法主要特点是采用更为先进的机器学习方法（如神经元网络），将多序列比对的信息作为神经元网络系统的输入，进行二级结构的测定，总体上精确度得到很大的提高，普遍可超过70%，代表性的方法有PHD和PSIPRED等。
百泰派克生物科技采用圆二色谱法提供蛋白二级结构分析等空间构型构象服务，欢迎免费咨询。
蛋白质三级结构的测定方法研究
蛋白质三级结构的测定方法研究一、绪论蛋白质是生命体中重要的基础分子，其三级结构（即α-螺旋、β-折叠和结构域）是其特殊的形态，“过度折叠及构象缺陷与很多疾病如糖尿病、白血病、巴金森氏症等形成联系，保持其完好的结构则是生物体长时间生存的关键。
因此，准确地测定蛋白质的三级结构一直以来是科学家们探索的重要课题。
本文将介绍蛋白质三级结构的测定方法，目的是深刻理解蛋白质的自由能和构象当量的关系，为结构生物学的进一步研究提供重要的技术支撑。
二、常用测定方法1. X-射线晶体学（X-ray Crystallography）X-射线晶体学是确定生物大分子三维结构的重要方法。
它利用晶体衍射技术，将X-射线往晶体内入射，从而形成的衍射数据，通过搜寻晶体中各点原子的相对位置，最后计算得到分子的三维结构。
X-射线晶体学经过数十年的技术不断突破和发展，现已成为生物大分子结构解析的重要工具之一。
2. 核磁共振（NMR）核磁共振是人们用于观测、确定物质内部结构、不同状态和反应机制等方式之一。
技术原理是将具有磁矩的原子或分子放入外磁场中，通过使它们的核磁矢量取向不同的方式，使它们的核磁矩发生共振。
由于不同类型的原子核共振的频率不同，其反应的响应信号也不同，这种特殊的信号可以通过电子设备处理和分析。
3. 电子显微学电子显微学是依靠通电电子束对物质进行成像的技术。
电子束足以穿透物质，但其处理样品的方法使得其分辨率高几十到数百倍，能够精确捕捉生物分子的高清晰度和高解析度图像。
电子显微学可以提供大量的生物大分子结构信息，例如膜蛋白、细胞器、纤维蛋白等等，是生物学领域最重要和常用的技术之一。
三、结论以上三种方法都是生物大分子结构解析的重要方法，每种方法各有优劣，需要根据实验需要和研究目的来进行选择。
X-射线晶体学明确了蛋白质的结构和分子相对位置， NMR 的方法可以测定蛋白质结构中的核心亚原子的相对位置，而电子显微学则可以为我们提供可信的高质量图像。
第二节蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，
但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or
各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交 换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自 动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98） 最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来， 三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸 （pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如 何呢? 苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比 较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减 弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮 氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧 链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。
（2）C-末端分析
A.肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸 留在上清中。 Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、 Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产 生游离的羧基末端aa。
（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根 据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应 时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和 数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作 动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残 基顺序。
e2-2蛋白质结构的柔性
e2-2 蛋白质结构的柔性柔性是蛋白质行使其生物功能所必需的。
一种蛋白质可能因突变而变得对热更加稳定，但如果以柔性的降低为代价，会导致这种蛋白质的功能的降低甚至丧失。
与生活在一般温度下的生物相比，生活在极端温度下的嗜热生物（thermophile）体内的酶具有嗜热的性质。
这些嗜热的酶在常温下活性很低，这是因为一般的温度限制了它们在结构上的柔性。
因为维持二级结构和三级结构的作用力都是弱键，所以在生理温度下有足够能量打破任何特定的次级作用。
当存在的次级键被打破的时候，其释放的基团能够建立新的作用，这些重排发生得极快，很难用一般的测定方法（如X射线衍射）检测到。
因此通过物理方法测定出来的蛋白质的三维结构实际上是一种平均结构。
在生理温度下，大多数蛋白质分子上的原子运动的距离在0.1nm左右，有时更远，这取决于它们在蛋白质中的位置。
在紧密折叠的蛋白质内部，原子运动被限制在0.1nm 以下。
与分子表面越近，运动性越强。
如果位于表面的基团周围没有其他原子，那么它们运动的距离可达零点几个nm。
蛋白质有时被称为半液体（semi-liquid），是因为它们的原子运动大于固体（如NaCl），但小于液体（如水）。
在一个蛋白质分子上，其多聚物的共价结构对原子和基团的运动造成了许多限制，像甲基或芳香族侧链通常表现为集体运动。
蛋白质运动可根据它瞬时的结构与平均结构的关系进行分类：最快的运动是原子的波动，如原子之间的振动和甲基的转动；其次是相邻的成键和没有成键的原子的集体运动，例如长侧链基团的摇摆运动和短肽环的上下翻转运动；最慢的运动是整个结构域发生的大规模构象变化。
结构域的构象变化一般是局部的，在通常的温度下，整个折叠的结构域从来不会发生大的受热驱动的变化。
从一种折叠模体转变成另外一种模体十分罕见，除非是在病理状态下，例如淀粉样斑块（amyloid）疾病和朊病毒引起的疾病（见下一节）。
然而，某些蛋白质会发生小规模的重折叠。
柔性使得某些蛋白质可以同时处在两个差别很大的构象状态。
蛋白质二级结构的测定方法及原理
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蛋白质二级结构的检测手段
蛋白质二级结构的检测手段
蛋白质二级结构是指蛋白质中氨基酸链的局部折叠形态，包括α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等。
二级结构的确定对于研究蛋白质的结构和功能很重要。
目前常用的蛋白质二级结构的检测手段主要有以下几种：
1. X射线晶体学：X射线晶体学是目前最常用的蛋白质结构测定方法，可以精确地解析蛋白质分子的三维结构，包括二级结构。
2. 核磁共振：核磁共振技术可以通过测量蛋白质分子内部的原
子核的自旋振荡情况，确定蛋白质的二级结构。
3. 红外光谱：红外光谱技术可以通过测量蛋白质中特定化学键
的振动频率，确定蛋白质的二级结构。
4. 圆二色谱：圆二色谱技术可以测量蛋白质中对左旋和右旋圆
极化光的旋转角度，从而确定蛋白质的二级结构。
5. 荧光光谱：荧光光谱技术可以通过测量蛋白质中特定氨基酸
残基的荧光发射光谱，确定蛋白质的二级结构。
综上所述，以上的检测手段可以相互补充，提供多维度的蛋白质结构信息，为研究蛋白质结构与功能的关系提供了重要的工具和手段。
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在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多， 应用得也最广泛。
蛋白质的质谱分析
质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、 肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。肽 和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作 等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。
蛋白质质谱分析原理为：通过电离源将蛋白质分 子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、 磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质 离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确 定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
圆二色谱的应用
在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测 定生物大分子的空间结构。
生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，
通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在
溶液状态下的二级结构。
蛋白质或多肽是由氨 基酸通过肽键连接而 成的具有特定结构的 生物大分子，主要的 光学活性生色基团是 肽链骨架中的肽键、 芳香氨基酸残基及二 硫键，另外，有的蛋 白质辅基对蛋白质的 圆二色性有影响。
椭圆偏振光：振幅不等的左、右圆偏振光合成
圆二色性和圆二色谱
圆二色性：当左、右圆偏振光进入物质时，光学 活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值 就是圆二色性 光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一 样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的 光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示
圆二色谱：指椭圆度(或比椭圆度等)与波长的关 系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。
冷冻电镜三维重构的基本技术路线:
利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定
然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像
利用高灵敏底片进行成像记录
利用高分辨率扫描仪对底片进行数字化
对数字化的图像进行二维图像分析——选点、分类、校正 和平均 最后完成样品的三维重构计算
蟑螂浓核病毒通过冷 冻电子显微镜技术进 行的病毒衣壳空间结 构的三维重构分析
平面偏振光：指振动方向在同一平面内的电磁波。 圆偏振光：当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位 相相差1/4波长(90°)时，其合成矢量绕光传播方向 旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端 轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向 顺时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋 转的则称左圆偏振光。
因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构
的方法：
现代光谱技术
三维电镜衍射技术 动力学全精研究技术
一、现代光谱技术
除传统的紫外-可见差光谱法和荧光光 谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以 及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面 发挥着重要的作用。
圆二色谱
（Circular Dichroism，CD）
肽键是高度有规律排列 的，其排列的方向性决 定了肽键能级跃迁的分 裂情况。具有不同二级 结构的蛋白质或多肽所 产生CD谱带的位置、 吸收的强弱都不相同。 因此，根据所测得蛋白 质或多肽的远紫外CD 谱，能反映出蛋白质或 多肽链二级结构的信息 ，从而揭示蛋白质或多 肽的二级结构。
- band(nm) α-螺旋 β-折叠 β-转角 左手螺旋P2结构 无规则卷曲 222，208 216 220-230(弱)，180190（强） 190 200
圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种 简单、快速而又较准确的方法。 圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振 光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。 1969年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了 蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色 谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。
平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光
直到1960年激光出现以后，由于激光具有高亮度、单色性 和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱 的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。
质谱(mass spectrometry，MS)
自美国科学家John B.Fenn和日本学者田中耕一(Koichi. Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱 分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物 质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研 究领域之一。 生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以 提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。 质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成 为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十 分重要的地位。
质谱分析基本原理
质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子， 于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方 法。 其过程可简单描述为：
离子源轰击样品→带电荷的碎片离子→电场加速 (zeU)→获得动能(mv2)→磁场分离→检测器记录
其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎 片质量，v为电子运动速度。
质谱分析(MS)的特点
MS用于生物大分子的研究具有以下优点: 高灵敏度 易操作性 准确性 快速性 很好的普适性
高灵敏度能为亚微克级试样提供信息，可以有效地与色谱
联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。
质谱分析的方法
近年来出现的较成功地用于生物大分子质谱分析 的软电离技术主要有下列几种： 电喷雾电离质谱 基质辅助激光解吸电离质谱 快原子轰击质谱
质谱中主要出现的离子有四种，即分子离 子、碎片离子、同位素离子和亚稳离子
分子离子
分子在离子源中失去一个电子形成的离子， 在质谱图中，分子离子对应的峰称分子离子峰。 特点： 分子离子含奇数个电子，分子离子峰出现在质谱 图的最右侧。 作用： 根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。
碎片离子：分子离子中的某个化学键断
fits best with xa = 80%, xb= 0% xc = 20%
agrees well with structure 78% helix, 22% coil
激光拉曼光谱
激光拉曼光谱法是研究生物大分子结构、 动力学及功能的重要手段，它在物理、化 学、医学及生物学等领域都有着十分重要 的应用价值。 在蛋白究进展。
+ band(nm) 192 195 205 210-230（弱） 212
α-螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm 处表现出两个负的特征肩峰谱带；β-折叠的CD光谱在 216nm有一负谱带，在185～200nm有一正谱带；β-转角在 206nm附近有一正CD谱带，而左手螺旋P2结构在相应的位 置有负的CD谱带，如上图和表所示。
三维重构技术的优势:
可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下， 电子显微学也可给出有意义的结构信息； 适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进 行分析的样品,如难以结晶的膜蛋白、大分子复合体等; 适于捕捉动态结构变化信息； 易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构 信息; 电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线 晶体学直接和方便。
CD数据拟合计算蛋白质的二级结构 的方法基本原理是假设蛋白质在波长λ处 的CD信号θ(λ)是蛋白质中或多肽各种二级 结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性 加，θ(λ)= Σfiθ(λ)i + noise。θ(λ)i是第i个二 级结构成分的CD信号值，fi为第i个二级结 构成分的含量分数，Σfi规定值为1；通过 已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构的圆 二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽的 圆二色数据，估算未知蛋白或多肽的二级 结构。
二、三维电镜重构法(3-dimension electron microscopy reconstitution)
三维电镜重构技术是电子显微束、电子衍射与计算机图像 处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电子显微镜在三维电镜重构技术中起着十分重要的作用， 电镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上有着特殊 的优势。 所谓三维电镜重构是指通过样品的一个或多个投影图得到 样品中各组成部分之间的三维关系。
裂而形成的离子，有些碎片离子获得能量 ，会进一步裂解成更小的碎片离子。 特点：m/z较分子离子小，碎片离子峰出现 在分子离子峰的左侧。 作用：反映分子的结构信息。
亚稳离子：离子受电场加速后，在飞行途中碎裂而产
生的离子，其对应的峰称为亚稳峰。
特点 ① 峰弱，强度仅为m 峰的1%～3%。
② 峰钝，一般可跨2～5个质量单位。
③ m/e一般不是整数，与母离子和子离子有下述关系： m* ＝m22 /m 1
用途
可以确定离子的亲缘关系， 有助于了解裂解规律， 解析复杂图谱。
例：对氨基茴香醚在m/z 94.8和59.2处，出现 两个亚稳离子峰（如图），试据此推断离子间的 裂解关系。
根据计算：1082 /123＝94.8；802 /108＝59.2， 证实裂解过程为： m/z123 → m/z108 → m/z80
蛋白质的质谱分析方法
MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法：
第一种方法称为蛋白图谱(protein mapping),它
是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切
成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,
将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已
知蛋白,从而获取待测蛋白序列；
第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中 产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质 量差，识别相应的氨基酸残基； 第三种方法称为梯状测序(ladder sequencing)， 是用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ端或Ｃ端逐 一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸 残基的系列肽，再经质谱检测，由相邻峰的质量 差可知相应氨基酸残基。
肽键的不对称性使得它总有光活性
蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠 结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能 量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围:
1）250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽 键的n→π*电子跃迁引起；远紫外CD主要应用于蛋 白质二级结构的解析 2）250～300nm的近紫外光谱区，主要由侧链芳香 基团的π→π*电子跃迁引起；近紫外CD主要揭示蛋 白质的三级结构信息 3）300～700nm的紫外-可见光光谱区，主要由蛋白 质辅基等外在生色基团引起。紫外-可见光CD主要 用于辅基的偶合分析。