端粒酶活性与良,恶性骨肿瘤细胞分化程度的相关性研究
端粒酶在肿瘤治疗中的应用
端粒酶在肿瘤治疗中的应用随着科技的快速发展，癌症的治疗也在不断进步。
其中，端粒酶在肿瘤治疗中的应用备受关注。
端粒酶作为一种酶类，有着很多重要的生物学职能，与人体的衰老、疾病进程密切相关。
通过对其在肿瘤治疗中的应用进行深入研究，我们不仅可以更好地了解它的作用，还能为治疗肿瘤提供更多的方案。
首先，什么是端粒酶？它是一种对DNA链末端的保护酶，能够延长端粒（一种DNA分子末端的重复序列）的长度和稳定性，从而防止DNA端的进一步缩短。
缩短的DNA端会导致DNA损伤、染色体错构等问题，进一步导致DNA重组，紊乱细胞的生命活动及基因表达，损伤细胞遗传物质和细胞凋亡等现象。
过度活化的端粒酶会增加细胞前体细胞的分裂频率和次数，使其具备不正常的增殖能力，为细胞的衰老和癌变埋下隐患。
端粒酶与癌症的关系也已经被广泛关注。
癌细胞通常表现出一些特殊的生物学行为，比如吞噬超过正常细胞水平的营养物质、增强生长及分裂能力、避开细胞周期中的自我保护机制等等，而端粒酶正是以一种形式与这些行为密切相关。
研究表明，大多数癌细胞都会显著增加端粒酶的活性，从而延长自身端粒的长度，为细胞增殖和复制提供必要的支持，因此研究端粒酶的功能，尤其是在肿瘤治疗中的作用，便成为了减缓和控制癌症传播的探讨重点。
在当前的癌症治疗领域中，通常采用化疗、放疗和手术的综合手段进行治疗，但这些方法会给人体造成一定的创伤和副作用。
而端粒酶作为一种新型的治疗手段，具有副作用小、疗效好等优点，因此逐渐受到了越来越多的研究人员的重视。
目前，对端粒酶在肿瘤治疗中的应用主要是针对癌细胞活性的干扰及调控。
例如，一些研究表明，在端粒酶的干扰情况下，癌细胞会关闭细胞周期中S期转录，从而影响组织的新陈代谢，减少癌细胞的可塑性和增殖能力。
此外，端粒酶还可通过抑制DNA开端的损伤和凋亡途径进行治疗。
研究表明在使用端粒酶在癌细胞中干扰蛋白，且与DNA修复途径相关的多种蛋白上调的情况下，可以促进细胞的凋亡，从而起到一定的治疗作用。
端粒和端粒酶与肿瘤的发展概况
qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasd fghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzx cvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui opasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuio pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfgh jklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvb nmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwe rtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop asdfghjklzxcvbnrtyuiopasdfghjklzxcv bnmrtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasd fghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzx cvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq端粒和端粒酶与肿瘤 发生的研究进展 学 院 ：生命科学学院专 业 ：生物工程 姓 名 ： 指导老师：关键词端粒酶;端粒酶抑制剂;肿瘤治疗在诸多探索中，肿瘤细胞永生化的“端粒 端粒酶学说”已为越来越多的研究结果所证实。
已有的研究表明，80%～90%的恶性肿瘤中均有端粒酶的活性表达，而大多数体细胞无端粒酶的活性，由此可见端粒酶的激活在细胞永生化及肿瘤的形成中具有十分重要的作用。
近年来端粒酶抑制剂的研究和开发为肿瘤治疗提供了新的思路，并有可能成为肿瘤治疗的突破。
端粒酶活性检测研究进展
第18卷第1期2018年3月应用技术学报JOURNAL OF TECHNOLOGYV0I.I8N0.IMar. 2018文章编号 $096-3424(2018)01-0001-13D O I：10. 3969/j.issn.2096-3424. 2018. 01. 001端粒酶活性检测研究进展郑婷婷，冯恩铎，田阳(华东师范大学化学与分子工程学院，上海200241)摘要：端粒酶是细胞内常见的一种逆转录酶，其功能在于维持细胞内染色体末端端粒的长度。
端粒酶活性的异常升高通常与肿瘤细胞的产生以及生长相关。
端粒酶的活性已经成为了癌症诊疗领域中非常重要的生物标志物。
因此，对于端粒酶活性准确且高效的定量分析检测方案是当今分析科学，临床医学等相关学科领域研究的重点之一。
随着分析测试技术的发展，提出了一系列具有超高性能的端粒酶活性检测方案。
总结了近5年来端粒酶活性检测方案的发展全貌并且预估了端粒酶活性检测的未来发展方向。
关键词：端粒酶；活性检测；电化学分析；荧光分析；拉曼分析；在体分析；研究进展中图分类号：O 657 文献标志码：AProgress in the Analysis of Telomerase ActivityZHENG Tingling，FENGEnduo，TIAN Yang(School of C hem istry and M olecular E ngineering，East China N orm al U n iv e rs ity，Shanghai 200241，China)Abstract：Telomerase is a common type of reverse transcriptase in ce lls，w hich plays an im p orta m aintaining the length of telom eres at the ends of chromosomes.There is always a tig h t relationshipbetween the g ro w th of tu m o r cells and the high expression of telomerase a c tiv ity.Telomerase a c tiv ity hasbeen a very im p o rta n t biom arker in the fie ld of cancer diagnosis and trea tm en t.e fficient quantitative analysis of telomerase a c tiv ity is one of the key points in the fie ld of analyticalscience，clinical medicine and other related disciplines.A series of novel telomerase a c tiv ity detectionmethods w ith very good analytical performance have been proposed w ith the development of testing technology.T h is article summarizes telomerase a c tiv ity detection scheme in the recent five yearsand we also forecast the fu tu re developm ent direction of telomerase a c tiv ity detection.Key words：telom erase；a c tiv ity detection；electrochemical analysis;fluorescence analysis;Ramananalysis；in-vivo analysis；research progress端粒是一段具有重复序列（T T A G G G)的D N A裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短[3]。
端粒酶在临床诊断和治疗中的应用
端粒酶在临床诊断和治疗中的应用摘要：端粒的长短和稳定性决定了细胞的寿命 ,并与细胞的衰老和癌变密切相关。
端粒酶在细胞中负责端粒的延长，能以自身携带的 RNA 为模板 , 不断合成新的端粒 DNA 序列添加到染色体末端, 弥补端粒丢失阻止端粒缩短。
端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，其激活与细胞的癌变密切相关。
它是所有癌症亚类细胞, 包括癌干细胞, 永生化所必需的成分。
在正常和肿瘤组织之间,端粒酶表达、端粒长度和细胞动力学存在明显的差异。
关键词：端粒酶;诊断;治疗;癌症前言：近年来, 端粒及端粒酶的研究已成为生物学热点, 随着对端粒酶的研究深入,应用靶向端粒酶的方法治疗肿瘤成为热点 ,并有较多的新进展, 是人类抗肿瘤药物研究的新“靶点”。
随着人们对端粒及端粒酶结构和功能认识的加深 ,针对端粒酶的抗肿瘤治疗研究也不断深入, 从早期抑制肿瘤细胞端粒酶活性 ,发展到新近与免疫治疗和基因治疗相结合端粒酶在临床上应用更广阔。
端粒酶是在细胞中负责端粒的延长的一种酶，能以自身携带的 RNA 为模板 , 不断合成新的端粒 DNA 序列添加到染色体末端, 弥补端粒丢失阻止端粒缩短。
端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，其激活与细胞的癌变密切相关。
端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。
端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。
人类端粒酶是一种由RNA和相关蛋白质组成的核酸蛋白质复合物，由与端粒DNA互补的RNA 模板(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相关蛋白(TEP1)和端粒酶催化亚单位(端粒酶逆转录酶 human telomerase reverse transcriptase, hTERT)三个亚基构成【1】。
其中以hTERT和hTR组成的端粒酶最小核心结构对维持端粒酶的活性有重要作用。
AA几种肿瘤常用检测方法
AA几种肿瘤常用检测方法1．端粒酶活性检测很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。
在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。
端粒酶常用检测方法1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。
人大部分体细胞都不表达端粒酶。
由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。
恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。
自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。
在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。
该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性。
但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤和肠腺瘤等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。
但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。
传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。
现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplificationprotocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别诊断提供了有效的手段。
但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。
端粒酶的起源_调控及与肿瘤关系的研究进展
端粒酶的起源、调控及与肿瘤关系的研究进展潘海乐综述 段德生审校(白求恩医科大学第三临床医学院,吉林长春130021) 【摘要】端粒酶的激活与恶性肿瘤发生发展之间存在着密切的关系。
有效地抑制端粒酶活性有可能导致肿瘤治疗方面的重大突破。
有关端粒酶自身起源及结构的深入研究有助于这一问题的解决。
本文对端粒酶的起源、组分、功能调控研究方面的最新进展进行了综述,并将端粒酶与肿瘤的关系予以总结和展望。
【关键词】 端粒; 端粒酶; 肿瘤中图分类号 R7301231 文献标识码:A 文章编号:100723639(2000)022*******Origin and regulation of telomerase and its correlation with carcinom a P AN Hai 2le ,DUAN De 2sheng.(The third clinical hospital o f Norman Berthune Univer sity o f Medical Science ,Jilin Changchun 130012,China )【Abstract 】:T elomerase ,a ribonucleoprotein enzyme ,is a key com ponent in maintaining the development of malignant tu 2m or andeffective deregulation of the telomerase activity in tom or cells may lead to the final overcoming of malignant tum ors.The latest research results on origin ,structure and regulation to telomerase were introduced in the article and the possible correlation of these discoverys with tum or menioned at the same time.【K ey w ords 】 telomere ; telomerase ; tum or第一作者简介:潘海乐(1970年出生),男,主治医师,博士。
端粒酶与肿瘤
端粒端粒酶与肿瘤摘要端粒是保护真核细胞末端的“帽子”，当端粒的长度因细胞复制而缩短达到极限时，细胞就会走向衰老甚至死亡，而端粒酶的存在能补充已经缩短的端粒，从而延长细胞的寿命甚至使其获得永生。
而众所周知，癌症细胞的分裂就是永无止境的，这就暗示端粒-端粒酶系统于人类肿瘤的形成与发展有着密切的联系，所以分析研究他们之间的关系对于肿瘤的研究有着重要的意义。
现代科学家已经针对他们关系，设计了一些治疗癌症的办法，虽然还没有达到治愈的效果，但是我们应该有充分的理由认为随着科技的进步，癌症的治疗会变的像感冒一样简单。
关键字端粒, 端粒酶（Telomerase）, 端粒结合蛋白, , 肿瘤近年来，随着人类基因组计划的完成，端粒与端粒酶的研究已成为国际肿瘤分子生物学的研究热点，很多实验都表明了，在肿瘤发生的很多阶段中,端粒缺失造成细胞染色体结构变化以及端粒酶的再激活都可能直接看参与细胞的癌变过程。
端粒酶几乎在所有类型的肿瘤中均有不同程度的表达,已被公认为目前已知的最为广泛的肿瘤标志物之一。
1端粒的结构和功能1.1 端粒的结构端粒是存在于真核细胞线形染色体末端的一段特殊的DNA和蛋白质的复合物, 平均长度约为5 ～15kb,是DNA链自身回折并与多种端粒结合蛋白复合而成。
人类端粒是以5′2 TTAGGG23′为重复单位的富含鸟苷酸的序列, 其结构末端是3′端, 3′端并不悬挂在端粒末端,而是折回到端粒内部双链重复序列的某一区域,并将该端区域的一段自身链置换出来,取而代之与互补链配对,形成的一个环称为T环, 3′最末端单链区反转探入端粒的双链区再形成D 环。
端粒结合蛋白包括端粒酶、保卫蛋白复合体及非保卫蛋白。
保卫蛋白复合体由端粒重复序列结合因子,结合因子2（ TRF2）,端粒保卫蛋白1 , TRF1 相互作用核蛋白,TIN2 相互作用蛋白1及阻抑和活化蛋白1 这6个蛋白组成,主要分布在染色体端粒上,保持端粒结构的稳定。
端粒酶作为肿瘤标志物的研究进展
端粒酶通过延长端粒序列来增加染色体稳定性，从而维持细胞寿命。在正常细胞中，随着细胞分裂次数的增加 ，端粒序列逐渐缩短，当端粒缩短至一定程度时，细胞进入复制停滞期或凋亡。而在肿瘤细胞中，端粒酶的表 达水平较高，能够维持端粒序列的长度，使肿瘤细胞逃避正常的细胞衰老和死亡过程。
端粒酶与肿瘤的关系
端粒酶活性可以预测肿瘤的预后，为患者和医生提供参 考。
04
端粒酶作为肿瘤标志物的 前景和挑战
提高检测灵敏度和特异性
总结词
提高端粒酶作为肿瘤标志物的检测灵敏度和特异性是 关键的挑战之一。这需要深入研究端粒酶的生物学机 制和肿瘤细胞中端粒酶的表达调控机制，以发现更特 异和敏感的检测方法。
详细描述
目前，已经有一些基于端粒酶的肿瘤标志物检测方法 ，如端粒酶活性检测、端粒酶RNA检测等。但是，这 些方法的灵敏度和特异性还需要进一步提高。例如， 一些非肿瘤疾病或良性疾病中也可能出现端粒酶活性 升高的情况，这会给诊断带来一定的干扰。因此，开 发出更特异和敏感的检测方法是非常重要的。
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《端粒酶作为肿瘤标志物的 研究进展》
2023-10-29
目 录
• 端粒酶概述 • 端粒酶的检测方法 • 端粒酶作为肿瘤标志物的应用 • 端粒酶作为肿瘤标志物的前景和挑战
01
端粒酶概述
端粒酶的生物学作用
端粒酶的组成
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体，其中RNA为模板，提供端粒重复序列，蛋白质为催化酶，促进端粒 DNA合成。
端粒酶研究的历史与现状
端粒酶的发现
20世纪80年代，科学家们发现了端粒酶，并认识到其在维持染色体稳定性和细胞寿命中的重要作用。
端粒酶作为肿瘤标志物的研究
端粒酶与肿瘤相关性研究进展
端粒酶与肿瘤相关性研究进展
石长安;张梦娜;赵晓民;范宁娟
【期刊名称】《畜牧兽医杂志》
【年(卷),期】2024(43)2
【摘要】端粒是一段存在于真核细胞染色体末端,随着细胞分裂而缩短的特殊结构。
端粒酶可延长端粒,但在正常人体细胞内活性较低或无活性。
大多数肿瘤细胞通过
激活端粒酶活性,延伸端粒达到细胞无限增殖的可能。
端粒酶的活性与肿瘤的发生
密切相关。
本文以近年来临床常见的恶性肿瘤为出发点,综述了其与端粒酶活性关
系及端粒酶抑制剂的最新研究。
【总页数】5页(P54-58)
【作者】石长安;张梦娜;赵晓民;范宁娟
【作者单位】西北农林科技大学附属中学;西北农林科技大学动物医学院;西北农林
科技大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852
【相关文献】
1.端粒酶、凋亡与卵巢肿瘤的相关性研究进展
2.人端粒酶逆转录酶与肿瘤相关性的研究进展
3.端粒酶活性与恶性肿瘤相关性研究进展
4.端粒酶与消化系肿瘤相关性
研究进展5.端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展
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端粒酶在肿瘤发生和转移中的作用机制
端粒酶在肿瘤发生和转移中的作用机制肿瘤是一种严重影响人类健康的疾病，其发生和转移机制一直备受研究者的关注。
近年来，关于端粒酶在肿瘤发生和转移中的作用机制的研究也引起了广泛关注。
本文将从端粒酶的功能、调控及其在肿瘤中的角色等方面，对其作用机制进行探讨。
1. 端粒酶的功能及调控端粒酶是一种保守的核酸酶，主要负责细胞端粒的延伸。
端粒是由TTAGGG序列组成的位于染色体末端的DNA序列，其主要作用是保护染色体的稳定性，防止染色体的断裂和融合。
而端粒在正常细胞中随着细胞的分裂而逐渐缩短，当端粒长度缩短到一定程度时，细胞进入老化状态或发生凋亡。
为了保持细胞持续增殖，肿瘤细胞通过激活端粒酶维持端粒长度，从而逃避老化和凋亡信号的调控。
端粒酶主要由两个亚基组成：端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶RNA (TR)。
TERT通过逆转录的方式引导TR合成端粒DNA序列，从而使端粒长度保持在一定范围内。
除此之外，端粒酶的活性还受到多种蛋白质的调控，比如端粒酶反义RNA （TERRA）和端粒结合蛋白等。
2. 端粒酶在肿瘤发生中的作用机制端粒酶在肿瘤发生中扮演着至关重要的角色。
一方面，肿瘤细胞中端粒酶活性的激活可以维持端粒的长度，从而使细胞可以无限次地增殖。
这一特性被认为是肿瘤细胞不受限制地分裂和扩张的重要保证。
研究表明，大多数肿瘤细胞都表达着高水平的端粒酶，并且其活性与肿瘤的侵袭和复发有关。
另一方面，端粒酶的激活也与肿瘤的起源和发展密切相关。
研究发现，在正常细胞中，端粒酶的活性被抑制，以避免细胞无限增殖导致的异常细胞扩张。
然而，当细胞遭受到外界的致癌因素或内部突变的影响时，端粒酶的活性可能会被激活，导致肿瘤的发生。
例如，在肺癌等肿瘤中，端粒酶的活性常常显著上调，与肿瘤的分级和预后密切相关。
3. 端粒酶在肿瘤转移中的作用机制肿瘤的转移是肿瘤恶化和预后不良的主要原因之一。
端粒酶在肿瘤转移中也发挥着重要的作用。
研究发现，端粒酶的过度活化可以促进肿瘤细胞的转移和侵袭能力。
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端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤细胞分化程度的相关性研究陈继革1 宋先舟1 陈 玲21 华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科,武汉 4300302 武汉市第十医院药剂科,武汉 430033 摘要 目的 探讨端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤生长发育的关系,为临床早期诊断骨肉瘤提供理论依据。
方法 采用银染法检测了56例良性骨肿瘤、90例骨肉瘤及其瘤旁组织细胞中的端粒酶(T elom erase ,TLM A )活性,探讨良、恶性骨肿瘤细胞端粒酶活性表达的差异以及端粒酶活性与骨肉瘤细胞分化程度的关系。
结果 骨肉瘤端粒酶的阳性率显著高于良性骨肿瘤,两者的瘤旁组织中皆无端粒酶活性表达;处于分化程度较差的骨肉瘤其端粒酶活性显著高于分化程度较高的骨肉瘤。
结论 检测骨肿块细胞中端粒酶的活性有助于良、恶性骨肿瘤的早期鉴别诊断,亦有助于了解骨肉瘤的恶性程度,为早期临床诊治提供重要的理论依据。
关键词 端粒酶; 骨肿瘤; 骨肉瘤; 分化中图法分类号 R 73811Rela tion sh ip between Telom era se Activ ity w ith Ben ign ,M a l ignan t BoneNeopla s ma and D ifferen ti a tion of O steosarcomaChen J ige 1,Song X ianzhou 1,Chen L ing 2et a l1 D ep a rt m en t of T raum a tology ,T ongj i H osp ita l ,T ongj i M ed ica l Colleg e ,H uaz hong U n iveristy of S cience and T echnology ,W uhan 4300302 D ep a rt m en t of P ha r m acy ,W uhan 10th H osp ita l ,W uhan 430033Abstract Objective To exp lo re the relati on sh i p betw een telom erase activity and the developm en t of ben ign ,m alignan t bone neop las m a to p rovide theo retical groundw o rk fo r early diagno sis of o steo sarcom a .M ethods T elom erase activities in 56ben ign bone neop las m as and 90o steo sarcom as and their adjacen t non 2tum o r tissues w ere detected by TRA P .T he differences of telom erase exp ressi on in ben ign and m alig 2nan t bone tum o rs ,and the co rrelati on betw een telom erase activity and the differen tiati on of o steo sarcom a w as investigated .Results Po sitive rate of telom erase in m alignan t bone tum o r w as sign ifican tly h igher than in ben ign bone tum o r ,w hatsoever ben ign bone tum o r o r m alignan t bone tum o r the telom erase activity of adjacen t non 2tum o r tissues w as negative .Po sitive rate of telom erase in the o steo sarcom a of h igh differ 2en tiati on w as sign ifican tly h igher than that in low differetiati on o steo sarcom a .Conclusion D etecti on of telom erase in bone tum o rs w as help fu l to the early diagno sis of ben ign and m alignan t bone neop las m as ,and understanding m alignancy of o steo sarcom a .Key words telom erase ; bone tum o r ; o steo sarcom a ; differen tiati on 陈继革,男,1970年生,主治医师 端粒(T elom ere )为真核生物染色体末端的串联重复结构,其功能是维护染色体的稳定,保持DNA 的完整复制。
端粒随着细胞的分裂而逐渐缩短,正常细胞终因染色体失去端粒的保护而面临着衰老与死亡。
端粒酶(T elom erase )能以自身所携带的RNA 模板合成端粒片段并将其加到染色体末端。
正常人体细胞(除精源细胞和少数造血干细胞以外)其端粒酶均为失活状态,然而永生化细胞和大多数肿瘤细胞中的端粒酶被激活,因而有高水平的端粒酶活性表达[1,2]。
本实验将探讨端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤生长发育的关系,为临床早期诊断骨肉瘤提供理论依据。
1 材料与方法111 临床资料1996年～2002年期间,共收集同济医院及武汉市第十医院146例骨肿瘤患者,年龄10岁～65岁,平均(20134±8139)岁。
良性骨肿瘤56例,包括第32卷第1期第68页2003年2月华中科技大学学报(医学版)J H uazhong U niv Sci T ech [H ealth Sci]V o l .32 N o.1 P.68Feb .2003骨瘤12例,骨样骨瘤44例。
骨肉瘤90例,其中9例属低恶髓内型,11例属皮质旁型,24例属继发型, 46例属高恶髓内型。
以上所有病理学诊断皆经本院病理科证实。
112 组织标本的采集与保存手术标本离体后,立即切取肿瘤组织和相应的瘤旁组织各500m g左右,剪除脂肪组织,在预冷的1×PB S中充分洗去血液,于015h内置液氮中冻存备用。
113 银染法检测端粒酶银染法是K i m1994年发明的一种很灵敏的检测端粒酶活性的方法[3],我们采用的方法是从K i m 的银染法略加改进而来,继承了其灵敏性,却没有放射性污染。
检测端粒酶必须避开RNA酶( RNA ase),所以本实验中所有玻璃和金属器皿必须以180℃烘烤8h以上;T IP头、EP管等塑料制品必须以焦磷酸二乙酯(D EPC)浸泡12h后再高压灭菌消毒,实验中所用到的双蒸水(dH2O)仍须去RNA ase处理,即将D EPC加入双蒸水中,配成1‰浓度的D EPC溶液作用12h后再经高压灭菌消毒,即为去RNA ase水,只有这样的去RNA ase水才能用于本实验中各种试剂的配置,本实验的所有操作必须戴手套完成。
11311 主要试剂:①洗涤缓冲液(W ash B uffer),1 mm o l L N222羟基乙哌嗪2N’222乙磺酸(H EPES); 1mm o l L M gC l2;1mm o l L KC l;1mm o l L二硫苏糖醇(D T T);1mm o l L二乙醇双(22氨基乙醚)四乙酸(EGTA)。
②裂解缓冲液(L ysis B uffer ),10mm o l L T ris2HC l,pH715;1mm o l L EGTA; 015%32[(32胆酰胺丙基)2二乙铵]2丙磺酸(CHA PS);011mm o l L苯甲基磺酰氟(PM SF);5 mm o l LΒ2巯基乙醇(Β2m ercap toehano l);10%甘油。
③引物:T S:5′2AA TCTCGA GCA GA GT T23′; CX:5′2(CCCT TA)3CCCT TA23′(由上海Sangon 公司合成)。
11312 10×TRA P反应液:20mm o l L T ris2HC l, pH813;115mm o l L M gC l2;63mm o l L KC l; 01005%吐温20(Tw een20);1mm o l L EGTA; 015mm o l L T4g32p ro tein(Boeh ringerM annhei m, Germ an)。
11313 提取细胞核物质:参照K i m的方法略加改进,取60m g冻存组织于400Λl预冷的洗涤缓冲液中用眼科剪剪碎,4℃离心2m in,弃上清,加200Λl预冷的裂解缓冲液,充分混匀后吸入组织匀浆器中,置冰上充分匀浆,冰上孵育30m in,4℃离心20m in,取上清,置新的EP管中-80℃冻存备用。
11314 TRA P反应:①反应体系,本实验总反应体积设计为50Λl,含10×TRA P反应液5Λl,1 mm o l L dN T P(Boeh ringerM annei m,Germ an)各215Λl,T S100ng,2m g m l牛血清白蛋白(B SA, P rom ega,U SA)215Λl,T aq DNA聚合酶1U (Boeh ringer M annei m,Germ an),细胞核提取物5Λl,补加H2O至48Λl,室温孵育30m in,加CX100 ng,用液体石蜡封顶后,置90℃反应2m in,灭RNA ase。
②PCR循环,将反应物置PCR扩增仪中(PEPCR480,U SA),循环时间和周期设计为:94℃30s,50℃30s,72℃30s,35个循环,最后72℃延伸2m in,产物置-80℃冻存备用。
11315 电泳及银染:取PCR产物10Λl,用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA GE),100V电泳约3h或溴酚蓝接近底部,电泳结束后仔细取下凝胶置10%ethano l中固定5m in,1%HNO3脱色3 m in,双蒸水漂洗2次,12mm o l L A gNO3染色30 m in,双蒸水漂洗2次,0128mm o l L N a2CO3及01019%Fo rm alin显色至全部条带显影,10%CH3 COO H固定5m in。