重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
转化及转化子的鉴定11243224 周雨一、感受态细胞的制备1、材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。
2、设备：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(Maconkey Agar)，0.05mol/L CaCl2溶液，含15%甘油的0.05mol/L CaCl2。
4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
5、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA 与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul 的37℃预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1 小时，烘干水，离心，3000-4000 r/min 1 min ，去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；11、进行菌种保藏，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。
重组质粒的构建转化筛选和鉴定 (2)
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。
所用的酶有Hin d Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。
由于Hin d Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。
关键字酶切连接转化重组子琼脂糖凝胶电泳引言重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
本实验的供体是λDNA，受体是E.coli DH5α,载体是PUC19。
DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。
这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。
目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类：Ⅰ类酶的识别部位和切点不同，切断部位不定；Ⅲ类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；Ⅱ类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。
因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是Ⅱ类酶。
酶切又分为单酶切和双酶切，单酶切就是只用一个限制性内切酶去切质粒,使环状的质粒被切割为一条或多条线状DNA,单酶切操作简单，但是后期筛选工作复杂；双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。
本实验所选用的限制酶是Hin d Ⅲ，选用方法是单酶切法。
重组质粒的构建解析
【器材】
水浴锅、灭菌Tip头、0.5mlPCR管、加样枪
【试剂】
Buffer、限制酶1、限制酶2、重组质粒、灭菌水
【实验步骤】
第一次使用本试剂盒时，请将RNase A1混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。实验操作前请将Solution Ⅲ置于4℃（或冰上）预冷后使用。
1.大肠杆菌的培养。
从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4 ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。
注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
5.当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。
6.若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。
7.本实验室有两种常用Marker,分别为DL2,000 DNA Marker和λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker。Agarose电泳图像示意图如下:
4.PCR
【器材】
6.目的片段与载体连接及转化...........................................................8
7.菌种保藏…………………………………………………………...9
8.双酶切反应..10
实验流程——质粒构建
基因提取——1、2、3
PCR反应扩增目的基因——4、3
【试剂】
琼脂糖（Agarose），TAE电泳缓冲液，EB，Marker
【实验步骤】
1.称取1g琼脂糖（Agarose）粉末于锥形瓶中，加入100mlTAE。保鲜膜封口，扎孔。
2.在微波炉中加热，沸腾两次，直到看不出油滴，形成均一的溶液。
3.倒入污染区的锥形瓶中，待冷却至60℃时加2ulEB，混匀。
重组质粒的构建与转化2解析
实验目的1.掌握通过酶切与PCR扩增鉴定重组DNA分子的基本方法。
2.学习和掌握PCR扩增的基本原理和实验技术。
实验原理1.酶切法鉴定重组DNA重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。
2.PCR扩增法鉴定重组质粒PCR反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源DNA片段，并可估测外源插入片段的大小，。
根据载体多克隆位点上下游基因的序列设计一对PCR引物，两引物之间的距离即是空载体PCR扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源DNA片段，就会改变PCR扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的距离即是插入片段的长度，也可以直接基于外源DNA两端的序列设计一对引物，分分别以空载体和重组质粒为模板进行PCR反应，只有重组质粒能扩增出一定大小的产物，则该产物的大小即是插入片段的大小。
3.PCR扩增原理具有模板DNA，寡核苷酸引物，Mg2+，4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和缓冲液所有组分的PCR反应体系中，在模板变性，引物退火后，模拟体内半保留复制过程——即在DNA聚合酶的作用下，以变性单链为模板，依据碱基互补配对原理，在引物的3’端加入合适的核苷酸分子，不断延伸直至完成新DNA的合成。
新合成的DNA分子也可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。
因此，变性、退火和延伸循环反复25~30次后，即可以从少量的模板DNA中扩增出大量的目的产物。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因插入到质粒中。
以下是同源重组构建质粒的一般步骤：
1. 选择合适的质粒载体：根据实验需要选择适当的质粒载体，通常选择含有适当多个限制酶切位点的质粒。
2. 执行酶切反应：将选定的质粒载体进行限制酶切反应，使用限制酶切酶将质粒切割为线性片段。
3. 扩增外源基因：使用PCR等技术扩增所需的外源基因片段，同时设计引物使得其两端带有与质粒载体的酶切位点相同的序列。
4. 接头连接：将扩增的外源基因片段与酶切后的质粒片段进行连接，使用连接酶将二者进行连接。
连接酶可以是T4 DNA连接酶等。
5. 转化宿主细胞：将连接后的质粒导入到合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌等。
6. 选取转化子：利用筛选法选择成功转化质粒的宿主细胞，可以使用抗生素等抗性筛选方法。
7. 确认质粒插入：通过PCR、酶切等方法对转化细胞进行筛
选和验证，确认质粒中外源基因的插入情况。
8. 提取质粒：从筛选验证通过的细胞中提取质粒，通常使用质粒提取试剂盒等方法进行质粒提取。
9. 验证质粒：通过测序等方法验证质粒中外源基因的序列，确认构建成功。
以上步骤仅为一般的同源重组构建质粒步骤，具体实验操作可能因实验设计和需求的不同而有所差异。
实验四.重组质粒载体的构建
生物技术大实验—实验四
重组质粒载体的构建
• 限制性酶切概述 • DNA片段的回收 • 重组质粒的构建 • 实验仪器设备 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿 抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理 图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶 切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序 列分析、基因组是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它 的基础上。
4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应 尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300360nm）,以减少紫外光切割DNA。 5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时 都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理 后才能清洗或丢。 6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将 胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒是一种常见的分子生物学技术，旨在构建具有特定序列或基因的质粒，以用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。
这种技术利用了同源重组在细胞中的自然发生机制，而不需要DNA 修饰或特殊的酶切酶或连接酶。
同源重组构建质粒的基本原理是将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段
的两端引入相同的特定序列，然后将两者共同转化至宿主细胞中，利用同源重组的机制完成质粒的重组。
在重组过程中，同源序列的两端会通过基因重组的方式将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段连接起来，形成具有目的基因或 DNA 片段的质粒。
由于同源重组构建质粒不涉及酶切酶或连接酶的使用，因此成本低廉，操作简便，因此被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
同源重组构建质粒的方法主要有两种：一种是利用 PCR 技术扩增目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列，将两者共同转化至宿主细胞中，完成质粒的构建。
另一种是将目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列合成，并利用 DNA 合成技术将其连接在一起，然后将构建好的质粒转化至宿主细胞中，完成重组。
需要注意的是，同源重组构建质粒的成功率受到多种因素影响，包括同源序列的长度、同源序列与非同源序列之间的比例、转化效率、质
粒长度等。
因此，在进行同源重组构建质粒之前，需要对实验条件进行优化和控制，以提高质粒构建的成功率。
总之，同源重组构建质粒是一种简便、低成本、高效的基因克隆技术，被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
随着分子生物学技术的不断发展，同源重组构建质粒的应用前景将更加广阔。
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国际检验医学杂志２０１２年３月第３３卷第５期 Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ２０
１２，ＶｏＬ ３３，Ｎｏ．５
・基础实验研究论著・ 重组金属硫蛋白２Ａ质粒的构建与表达
刘振杰 ｗ，赵树勇 ，周 静 ，骆艳婷 ，郑慧玲 ，陈维春 ，熊兴东 。，徐 宁 ，刘新光 （１．广东医学院衰老研究所，广东东莞５２３８０８；２．广东省中医院检验科，广州５１０３７０； ３．广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞５２３８０８）
・ ５１３ ・
摘要：目的 构建重组金属硫蛋白２Ａ（ＭＴ一２Ａ）原核表达质粒，并在大肠埃希菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达，为进一步研究ＭＴ一２Ａ 奠定基础。方法 从人骨骼肌细胞ｃＤＮＡ文库中ＰＣＲ扩增ＭＴ－２Ａ基因ＤＮＡ序列，构建重组表达质粒ＭＴ２Ａ－ｐＥＴ３２ａ，ＰＣＲ与 ＤＮＡ测序法鉴定插入序列；重组细菌用ＩＰＴＧ诱导表达，Ｈｉｓ—ｂｉｎｄ亲和层析柱纯化ＭＴ－２Ａ蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定蛋白特性。 结果扩增获得的ＭＴ一２Ａ基因片段长１８６ ｂｐ，ＤＮＡ测序证实ＭＴ２Ａ—ｐＥＴ３２ａ重组质粒构建正确；表达的融合蛋白相对分子质量 约为２９×１０。，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实为目的蛋白。结论 成功构建了重组原核表达质粒ＭＴ２Ａ－ｐＥＴ３２ａ，在大肠埃希茵内诱导表 达并纯化获得ＭＴ一２Ａ。 关键词：基因表达； 金属硫蛋白２Ａ； 重组质料； 大肠埃希菌 ＤＯＩ：１Ｏ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．０５．００１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２Ｏ１２）０５—０５１３一Ｏ２
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ２Ａ Ｌｉｕ Ｚｈｅｎｊｉｅ ’。 ，Ｚｈａｏ Ｓｈｕｙｏｎｇ ，Ｚｈｏｕ Ｊｉｎｇ ，Ｌｕｏ Ｙａｎｔｉｎｇ ，Ｚｈｅｎｇ Ｈｕｉｌｉｎｇ ， Ｃｈｅｎ Ｗｅｉｃｈｕｎ ，Ｘｉｏｎｇ Ｘｉｎｇｄｏｎｇ ，Ｘｕ Ｎｉｎｇ ，Ｌｉｕ Ｘｉｎ ｇｕａｎｇ ’。 （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｄｏｎｇｇｕａｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２３８０８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＧｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０３７０，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｄｏｎｇｇｕａｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２３８０８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ２Ａ（ＭＴ－２Ａ）ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＭＴ－２ Ａ ｃＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｉｎ— ｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ３２ａ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＭＴ２Ａ－ｐＥＴ３２ａ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＭＴ一２Ａ， ｗａｓ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＭＴ－２Ａ ｗａ８ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ—ＭＴ２Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １８６ ｂｐ ｗａｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＭＴ２Ａ—Ｐｅｔ３２ａ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２９×１０。，ａｎｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉ— ｆｌｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＭＴ２Ａ—ｐＥＴ３２ａ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｍｅｔａｌ１ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ２Ａ； ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
金属硫蛋白（ｍｅｔａｌ１ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）最早从马肾中分离而 来，是一类低相对分子质量，富含半胱氨酸，无芳香族氨基酸， 能与金属离子结合，普遍存在于生物界的独特的蛋白质口 ］。 哺乳动物组织中主要含有４种ＭＴ，即ＭＴ＿ｌ、ＭＴ一２、ＭＴ～３和 ＭＴ一４。ＭＴ一２Ａ是ＭＴ一２中惟一具有生物学功能的蛋白 质［３－４］。研究表明ＭＴ一２Ａ不仅具有重金属解毒、清除自由基、 抗辐射、修复组织损伤、抗衰老及调节微量元素等作用，也与细 胞增殖、凋亡及多种肿瘤的发生、发展和耐药密切相关［５ ］。本 研究构建了ＭＴ－２Ａ原核表达载体，并在大肠埃希菌中诱导表 达，为进一步研究其功能奠定了基础。 １材料与方法 １．１试剂ｐＥＴ３２ａ质粒和ＪＭ１０９、ＢＬ２１菌种均由本室保存。 人骨骼肌细胞ｃＤＮＡ文库ＡＤ质粒由本课题组构建¨８ ；Ｔａｑ 酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ和ＤＮＡ分子标记物购自 ＴＡＫＡＲＡ公司；蛋白分子标记物、ＰＣＲ产物纯化试剂盒购自 上海生工公司；Ｈｉｓ６多克隆抗体购自Ｔｉａｎｇｅｎ公司；Ｈｉｓ・Ｔａｇ 融合蛋白纯化试剂盒和ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ裂解液购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司； 抗ＭＴ抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。 １．２方法 １．２．１ 引物设计与合成 根据ＭＴ一２Ａ序列（ＮＭ～００５９５３．２） 采用ＯＬＩＧＯ软件设计引物。上游引物ＭＴ２Ａ１为：５＇－ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＣ Ｔ一３ ，其５ 端包含 ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点；下游引物ＭＴ２Ａ２为：５．＿ＣＣＧ ｃＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＣＡ Ｃ一３ ，其５ 端包含Ｘｈｏ Ｉ酶切 位点。引物由上海生工公司合成。 １．２．２ ＭＴ一２Ａ的扩增与表达质粒ＭＴ２Ａ—ｐＥＴ３２ａ的构建 用所设计引物，从人骨骼肌细胞ｃＤＮＡ文库ＡＤ质粒中扩增 ＭＴ一２Ａ ＤＮＡ片段，反应体系总体积为５Ｏ Ｌ，其中引物 ＭＴ２Ａ１、ＭＴ２Ａ２各２５ ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ缓冲液５ ｐ＿Ｌ、Ｔａｑ酶 １ Ｕ、ｄＮＴＰ混合物（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ Ｌ、ＡＤ质粒１ Ｉ 。反应参 数为：９４℃５ ｍｉｎ，９４℃３０ ｓ、５８℃３０ ｓ、７２℃１ ｒａｉｎ，循环３５ 次，７２℃１０ ｒａｉｎ。取１ Ｌ ＰＣＲ产物进行１ 琼脂糖凝胶电
＊ 基金项目：国家自然科学基金（３ｏ６７２２Ｏ５，３０８７１４４０，３０９７１６２０，８１１７０３２７）；广东省自然科学基金（９２５２４０２３０１０００００２，７３０１５０６）；广东省高 校自然科学研究重点项目（０６Ｚ０１５）；广东省医学科研基金项目（Ｂ２００９１９１）；湛江市科技局招标项目（ＺＺ０６０５）和东莞市科技计划项目
（２００８１０８１０１０４５）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｇｌｉｕ６４＠１２６．ｃｏｒｎ。 ・ ５１６ ・ 表２ 各组小鼠血清ＩＬ一６、ＩＬ一８检测结果（ ±ｓ） 国际检验医学杂志２０１２年３月第３３卷第５期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．５
△：与对照组比较，Ｐ＜０．０５；＃：与模型组比较，Ｐ＜Ｏ．０５； ：与黄 芪组比较，Ｐ＜０．０５； ：与赤芍组比较，Ｐ＜Ｏ．０５。
３讨 论 ＩＬ一８水平升高与肝脏炎性损害密切相关，在一定程度上 反映了肝损伤程度 ］。ＢＣＧ联合ＬＰＳ诱导的小鼠免疫性肝损 伤模型类似于人病毒性肝炎的急性或亚急性损伤过程，是研究 病毒性肝炎的理想模型［６］。本研究结果显示，与正常组比较， 模型组血清ＡＬＴ、ＡＳＴ水平升高（Ｐ＜Ｏ．０５），表明造模成功。 黄芪中的黄芪多糖是黄芪主要有效成分，对细胞、体液及非特 异性免疫和细胞因子活性均有调节作用＿７］。有研究显示，赤芍 可抑制抑制性Ｔ细胞的功能，对体液和细胞免疫有较强抑制 作用，可作为免疫抑制剂用于肝脏移植术或治疗自身免疫性肝 病等 ”］。３个给药组小鼠血清ＩＬ一６、ＩＩ 一８水平低于模型组 （Ｐ＜Ｏ．０５），说明黄芪、赤芍及黄芪赤芍合剂均能有效降低免 疫性肝损伤模型小鼠血清ＩＬ一６、ＩＬ－８水平。与黄芪、赤芍组比 较，黄芪赤芍合剂组血清ＩＬ－６、ＩＬ－８水平更低（Ｐ＜Ｏ．０５），说明 黄芪赤芍合剂比黄芪或赤芍单一用药更能显著降低模型小鼠 血清ＩＬ－６、ＩＬ－８水平。 综上所述，黄芪、赤芍、黄芪赤芍合剂均能降低免疫性肝损 伤模型小鼠血清ＩＬ－６和ＩＬ一８水平，黄芪赤芍合剂优于黄芪、赤 芍单独用药；监测接受黄芪或赤芍治疗的肝脏疾病患者血清 ＩＬ一６、ＩＬ一８水平有助于合理用药、疗效观察及预后判断。
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