D-松醇对STZ诱导2型糖尿病小鼠肝损伤的干预作用

一　．．　一中国食品添加剂　堕堡　Ｄ一松醇对ＳＴＺ诱导２型糖尿病小鼠肝损伤的　干预作用　

张泽生　，秦程广，李雨蒙　（１．天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津３００４５７；　２．天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津３００４５７）　

摘要：目的：采用高脂高糖饲料喂养ＩＣＲ小鼠４周后腹腔注射链脲佐菌素（ＳＴＺ）建立２型糖尿病动物　模型。灌胃Ｄ一松醇５周后，通过对小鼠空腹血糖（ＦＢＧ）、肝脏质量、肝指数、血清中丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）　含量和天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）含量进行测定，以及在光镜下观察各组小鼠肝组织细胞病理形态学改变，评　价Ｄ一松醇对２型糖尿病小鼠肝损伤的干预作用。结果：与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中ＡＳＴ、　ＡＬ　水平极显著性升高（Ｐ＜０．０１），ＨＥ染色显示模型对照组小鼠较正常对照组小鼠肝细胞脂肪变性明显，肝　组织结构不清楚，肝细胞排列紊乱。与模型对照组相比，剂量组小鼠血清中ＡＳＴ、ＡＬＴ水平显著性降低（Ｐ　＜０．０５），ＨＥ染色显示剂量组小鼠较模型对照组小鼠肝细胞脂肪变性明显减少，肝细胞排列基本规则。结论：　Ｄ一松醇能显著性降低糖尿病小鼠的空腹血糖（ＦＢＧ）、降低血清中丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）和天门冬氨酸氨　基转移酶（ＡＳＴ）活力，说明Ｄ一松醇可以减轻糖尿病小鼠肝脏损伤，有一定的护肝作用。　关键词：Ｄ一松醇；肝损伤；干预作用　中图分类号：ＴＳ２０２．３／Ｒ７８１．６＋４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—２５１３（２０１６）１２—０１０９—０６　

Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄ。＾——ｐｉｎｉｔｏｌ　ｏｎ　ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ＳＴＺ・＿——ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｅ　

ＺＨＡＮＧ　Ｚｅ－ｓｈｅｎｇ术，ＱＩＮ　Ｃｈｅｎｇ—ｇｕａｎｇ，ＬＩ　Ｙｕ・ｍｅｎｇ　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７；２．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓａｆｅｔｙ＆Ｌｏｗ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄ－ｐｉｎｉｔｏｌ　ｏｎ　ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｅ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｆｅｄ　ｅｎｒｉｃｈ—ｆｏｏｄ　ｆｏｒ　４　ｗｅｅｋｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ　ＳＴＺ．Ａｆｔｅｒ　５　ｗｅｅｋｓ　ｏｆ　ａ　ｄａｉｌｙ　ｄｏｓｅ　Ｄ—ｐｉｎｉｔｏｌ，ｓｏｍｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄｉｎ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｔｈｅａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＦＢＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｅｌｌｂｙ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ＡＳＴ、ＡＬＴ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１；ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ｍｉｃｅ，ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｃｌｅａｒ，ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ．Ｃｏｍｐ￣ｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，Ｄ—ｐｉｎｉｔｏｌｇｒｏｕｐ　ｓｈｏｗｅｄ　ＡＳＴ、ＡＬＴ　ｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　（Ｐ＜０．０５），ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｗｅｌｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｄ－ｐｉｎｉｔｏｌ　ｃａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＦＢＧ　ａｎｄ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈｅ　ｖｉｔａｌｉｔｙ　ｏｆ　ＡＬＴ　ａｎｄ　ＡＳＴ　

收稿日期：２０１６－０６—２３　通讯作者　作者简介：张泽生（１９５６一），男（汉），博士，教授，研究方向为天然产物活性成分。　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍｉｃｅ．Ａｌｌ　ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｄ——ｐｉｎｉｔｏｌ　ｈａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ　ｆｒｏｍ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄ—ｐｉｎｉｔｏｌ；ｌｉｖｅｒ　ｄａｍａｇｅ；ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　

过去人们对糖尿病的聚焦点主要在神经损　害、血管损害、肾损害，然而肝脏作为调节血糖　最重要的器官，肝功能在糖尿病治疗中的作用正　被更多的人关注…。肝脏是参与机体糖代谢的重　要组织之一，在稳定血液中葡萄糖水平方面起到　关键作用，与此同时，肝脏也是维持餐间空腹血　糖稳态的主要葡萄糖输出器官，而且餐后肠道吸　收所增加的血糖有１／３由肝脏处理【２Ｊ。然而糖尿　病患者由于不稳定的血糖水平以及居高不下的血　糖含量，从不同程度上会对肝脏造成损伤，引发　各种慢性肝病。研究表明，糖尿病与各种慢性肝　病之间存在着一定的联系［３】，因此各种保肝护肝　的药物和保健品相继产生。Ｄ一松醇能够提高机　体对胰岛素的敏感性，调节血糖水平，从而减轻　由糖尿病引起的肝脏损伤。　如图１所示，Ｄ一松醇是多元环肌醇３号位　羟基甲醚化产物的一种异构体。Ｄ一松醇具有类　胰岛素的作用，用于治疗由胰岛素耐药性引起的　相关疾病，如血脂异常、粥样动脉硬化等［４　】。　三　＝　ＯＣＨ３　图１　Ｄ一松醇结构式　Ｆｉｇ．１　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｏｒｍｕｌａ　ｏｆ　Ｄ—ｐｉｎｉｔｏｌ　本实验采用高脂高糖饲养联合腹腔注射小剂　量ＳＴＺ诱导２型糖尿病小鼠模型，该模型具有　糖脂代谢紊乱、肝脏脂肪变性等特征。通过对实　验小鼠肝脏中的一些生理生化指标进行检测，观　察肝组织病理变化，来验证Ｄ一松醇是否具有缓　解糖尿病对小鼠肝脏损伤的作用，从而为研发与　Ｄ一松醇相关的保肝护肝类功能性产品提供理论　依据。　１材料与方法　１．１实验动物　ＳＰＦ级雄性Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（ＩＣＲ）小鼠７５只，体重（２０±２ｇ），购自北京　大学医学部实验动物中心，许可证编号【ＳＣＸＫ　（京）２００１—００１２］。　１．２材料与设备　Ｄ一松醇购于西安一品生物技术有限公司　（纯度９５％）；实验动物基础饲料，北京维通利　华实验动物技术有限公司；ＳＴＺ，美国Ｓｉｇｍａ公　司；小鼠丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转　移酶、肝糖原试剂盒，中生北控生物科技股份有　限公司；血糖试纸，美国ｌｉｆｅｓｃａｎ公司。　ＸＳ２０５电子天平，ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯＬＥＤＯ公　司；ＯｎｅＴｏｕｃｈ血糖仪，美国强生公司；ＵＶ－　１８００分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；　ＢＸ５３Ｆ正置荧光显微镜，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司；　ＧＳＯＲＶＡＬＬ　ＬＥＧＥＮＤ　ＭＩＣＲＯ　１　７Ｒ离心机，美国　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司。　１．３实验方法　１．３．１糖尿病小鼠模型的建立　实验动物始终饲养于洁净级动物房中，恒　温（２３±２℃）、恒湿（７０％）条件稳定，并保持　１２ｈ明暗交替。７５只实验小鼠喂饲基础饲料进行　１周适应性饲养后，随机选取ｌ５只禁食１２ｈ，测　空腹血糖，作为该批次动物基础血糖值。之后随　机分笼、标记、称重，分正常对照组（１５只）、　模型组（６０只）。正常对照组喂饲正常饲料，模　型组喂饲高脂高糖饲料，４周后禁食（不禁水）　１２ｈ。将ＳＴＺ溶解于无菌ｐＨ　４．２～４．５、０．１ｍｏｌ／Ｌ　的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲溶液中，溶液注射浓　度为０．１ｇ，Ｌ。模型对照组小鼠按体重一次性腹腔　注射ＳＴＺ　１２０ｍｇ／ｋｇ・ｂｗ，正常对照组则按体重　一次性腹腔注射等量缓冲溶液。１周后禁食（不　禁水）１２　ｈ，测血糖，模型对照组小鼠血糖值在　１１．１～２５．０ｍｍｏｌ／Ｌ区间内的４０只小鼠为高血糖　造模成功动物【引。　１－３．２实验动物分组　将４Ｏ只造模成功小鼠按空腹血糖水平随机　分为４组，即模型对照组（ｃ）、低剂量组（ＤＬ）、　中剂量组（ＤＭ）、高剂量组（ＤＨ），每组ｌ０只，　组间血糖差异不大于１．１ｍｍｏｌ／Ｌ。再选取１０只同　一批次的正常小鼠作为正常对照组（Ｎ），开始　进入实验阶段。期间保证实验动物自由饮水、摄　食，每天观察精神状况、活动、饮食、饮水、体　毛色泽情况。　实验设计方案如表１所示。　表１实验设计方案　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ｇｒｏｕｐｉｎｇ　ｍｉｃｅ　注：高脂高糖饲料配方为：５０％基础饲料，２０％白砂糖　１６％猪油，１１％酪蛋白，１％明胶，１％胆固醇，０．５％胆酸盐　０．５％矿物质，０．５％维生素。　１．３．３血糖测定实验　每７ｄ测定血糖值，禁食（不禁水）１２　ｈ后　剪尾取血，用血糖仪测定空腹血糖值。血糖下降　百分比＝（实验前血糖值一实验后血糖值）／实　验前血糖值×１００％。　１－３．４肝脏生理生化指标检测　１．３．４．１肝脏指数　肝脏指数＝（肝脏质量／体重）Ｘ　１００　１．３．４．２丙氨酸氨基转移酶的测定　参照中生北控丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用　说明书操作进行测定。　测定原理：谷丙转氨酶催化Ｌ一丙氨酸的　氨基转移，生成丙酮酸。丙酮酸与ＮＡＤＨ在　ＬＤＨ的催化下反应生成乳酸和ＮＡＤ　。ＮＡＤＨ在　３４０ｎｍ处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清　中ＡＬＴ的活性成正比，在３４０ｎｍ处测定ＮＡＤＨ　下降速率，即可测出ＡＬＴ活性。　塑　１．３．４．３天门冬氨酸氨基转移酶的测定　参照中生北控丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用　说明书操作进行测定。　测定原理：谷草转氨酶催化Ｌ一天冬氨酸的　氨基转移与ＭＤＨ催化的反应偶联，使ＮＡＤＨ氧　化成ＮＡＤ　。ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处有特异吸收峰，　其被氧化的速率与血清中的ＡＳＴ的活性成正比，　在３４０ｎｍ处测定ＮＡＤＨ下降速率，即可测出　ＡＳＴ活性。　１．３．５肝脏组织切片的病理学观察　１．３．５．１组织固定　ａ．每只小鼠肝脏的肝小叶剪下体积约ｌｍｍ　的组织块；　ｂ．浸于提前配好的福尔马林固定液中固定　１２ｈ；　Ｃ．流水冲洗１２ｈ；　ｄ．组织脱水及透明：５０％乙醇（２～３ｈ）　一７０％乙醇（２～３ｈ）一８０％乙醇（３～５ｈ）　一９５％乙　醇（４０ｍｉｎ）　一１００％乙　醇Ｉ　（３０ｍｉｎ）一１００％乙醇ＩＩ（３０ｍｉｎ）一二甲苯Ｉ　（３０～５０ｍｉｎ）一二甲苯ＩＩ（３Ｏ～５０ｍｉｎ）；　ｅ．浸蜡及包埋：将上一步经二甲苯处理透　明后的肝组织浸于６０～６５℃烧熔的石蜡中浸泡　２．５ｈ～３ｈ，然后进行肝组织包埋，静止冷却后　４℃保存；　ｆ．组织切片：切片一展片一分片一捞片一烘　片（６ｈ～１２ｈ）。　１．３．５．２　ＨＥ染色　ａ．切片脱蜡：二甲苯脱蜡Ｉ（１Ｏｍｉｎ）一二　甲苯脱蜡ＩＩ（１０ｍｉｎ）一１００％乙醇Ｉ脱二甲　苯（２ｍｉｎ）一１００％乙醇ＩＩ脱二甲苯（２ｍｉｎ）