成骨细胞与破骨细胞的共培养体系

破骨细胞与成骨细胞

破骨细胞 (osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨组织成分的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase）和组织蛋白酶K（cathepsin K）是破骨细胞主要标志。破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell, MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个紧密堆积的核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。作用破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship 陷窝。在陷窝内对着骨质的

一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶K和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。成骨细胞成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌

成骨细胞培养

成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， 25 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。成骨细胞鉴定：

活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 ? 茜素红染液操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用 1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。 2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

软骨细胞培养

软骨细胞培养 (1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。 (2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。 (3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。 (4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。 (5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37℃、5%CO2。 (6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。 (7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。药物制备龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成 10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。

成骨细胞与破骨细胞的研究探讨

成骨細胞與破骨細胞的研究探討林文彬林園中醫診所台北市立聯合醫院中興院區摘要成骨細胞是骨形成過程中的重要功能細胞。70年代中期還認爲破骨細胞與成骨細胞爲共同的祖代來源，但自80年代初開始，認識到破骨細胞來源於單核吞噬細胞系統之外的骨髓生血細胞系統，爲獨立於骨髓幹細胞系統的一個細胞系。成骨細胞的功能是合成、分泌膠原與糖蛋白，形成骨基質；參與破骨細胞性骨吸收的調控作用；維持骨的代謝平衡。而破骨細胞是一個高度分化的多核大細胞，其主要功能爲吸收骨，成骨細胞受下列因數調節：轉化生長因數β(TGF-β)、1，25(OH)2D3、胰島素樣生長因數(IGF)、白細胞介素1(IL-I)、雌激素、腫瘤壞死因數α(TNFα)、骨形成蛋白(BMP)，骨吸收的主要調節因數有：降鈣素(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、前列腺素(PGs)、活性維生素D3(1，25(OH)2D3)、細胞因數、腫瘤壞死因數(TNFα、β)、干擾素(IF)、白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-17(IL-17)。關鍵詞：成骨細胞破骨細胞

前言骨質疏鬆症是骨吸收與骨形成之間的平衡被打破，骨吸收佔優勢而使骨量減少，成骨細胞和破骨細胞是骨組織特有的兩種細胞，在激素及細胞因數等作用下作用於骨，是骨代謝過程中的重要核心細胞。故對成骨及破骨細胞的研究，對於理解骨質疏鬆的發病及藥物的療效都具有重要意義。成骨細胞及破骨細胞的來源（一）成骨細胞的來源成骨細胞(Osteoblast OB)是骨形成過程中的重要功能細胞。成骨細胞的主要功能是分泌骨基質(包括膠原與糖蛋白)及進行合成。其分泌的膠原95％爲I型膠原蛋白(1)。此外還有少量的Ⅲ型、IV型及V型膠原，可見於小鼠、雞和人胚的成骨細胞。成骨細胞還參與破骨細胞性骨吸收的調節，兩者是骨代謝過程中的重要核心細胞。成骨細胞的起源，經大量研究現己公認：成骨細胞來源於末分化的多潛能幹細胞，這種幹細胞具有分化爲多種細胞類型的特徵，在各種調控因數的作用下，通過複雜的分子機制，間充質多潛能幹細胞可以分化爲成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞以及肌細胞等。當成骨細胞的祖代細胞接近骨表面時，則演化爲具有分泌、合成膠原基質的成骨細胞。當類骨質經過礦化過程以後，成骨細胞己進入分化的終末階段，其本身包埋於礦化的骨基質中成爲骨細胞。成骨細胞本身並不增殖，在體內無增殖能力。但是將成骨細胞進行體外培養，則具有分裂能力。被埋入礦化骨基質後的成骨細胞己成熟爲骨細胞，並成爲終末分化細胞。骨細胞以其身的許多胞漿突起，相互連接，傳遞資訊及進行物質交換。新形成的骨細胞具有一定的活性；逐漸老化的骨細胞則體積縮小，細胞核發生萎縮，失去活性，最終被骨吸收過程中的吞噬細胞消化、吸收。此外，來源於未分化的間充質中多潛能成骨細胞系中，還有一種類型細胞爲骨內襯細胞被覆於骨的表面，呈扁平狀、橢圓型胞核，無成骨及破骨功能。經研究認爲，這種帖附於骨表面的骨內襯細胞，參與了破骨細胞性骨吸收過程，並對骨代謝過程中的鈣、磷在細胞外液中的流動起了調控作用。由此可見成骨細胞處於功能活躍狀態時，分泌全盛骨基質，最終包埋於骨基質中；而無成骨功能的細胞，最終以骨內襯細胞形式被覆於骨的表面呈休止態。（二）破骨細胞的來源破骨細胞是高度分化的多核巨細胞，直接參與骨吸收，是骨組織吸收的主要功能細胞。破骨細胞的來源：由於長期以來對於破骨細胞(Osteoclast，OC)的來源問題一直不清楚，給研究工作帶來許多困難，因而對臨床各種骨疾患的診斷及其防治，也不可能進一步深入和提高。對於破骨細胞來源的認識，在二十世紀40-70年代，普遍應用的經典理論爲多潛能的骨源細胞學說，認爲破骨細胞是由骨源細胞融合而成。直至70年代中期還認爲OC與成骨細胞(OB)爲共同的祖代來源。這種觀點多年來一直是個疑問，不能被證實，現已被否定。自80年代初開始，提出了OC來源於骨外生血系統，自此又出現了三種不同觀點： 1. OC源於單核吞噬細胞系統，即由單核細胞融合而成，這一觀點現已被否定。 2. OC與單核吞噬細胞共同來源於骨髓生血系統的同一前身細胞，之後各自向不同方向分化。這一假說也被實驗研究所推翻。研究表明，由骨髓而來的單核細胞經培養之後，可以分化爲破骨細胞，但是末梢血中的單核細胞與腹腔中的單核巨噬細胞，經培養後並不能形成破骨細胞，而且前者與破骨細胞的細胞膜上有不同的表面抗原，這提示了破骨細胞與單核巨噬細胞兩者不是來自共同的祖代。 3. OC來源於單核吞噬細胞系統之外的骨髓生血細胞系統，爲獨立於骨髓幹細胞系統的一個細胞系(2)。Walker曾採用患有硬化病的小鼠及正常小鼠進行了血循聯體實驗，結果患硬化病的小鼠恢復了正常。研究表明，破骨細胞胞漿中碳酸酣酶Ⅱ(CAⅡ)基因突變可以引起骨硬

rhIGF1对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节作用

天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的在成骨细胞(ostelblast，OB)及破骨细胞(Osteoclast,OC)的表面均表达有胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF—I)的受体，IGF．I对这两种细胞也都具有激活作用。IGF．1在调节骨代谢平衡中具有重要作用，被认为是存在于RANKL／OPG系统之上，调节成骨细胞与破骨细胞相互作用的核心分子。为此，本文拟探讨不同浓度的rhlGF．I对成骨细胞和破骨细胞的直接作用，及对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节。方法 1．利用50ng／ml的RANKL诱导小鼠破骨前体细胞系分化为成熟破骨细胞。TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)鉴定。 2．以50ng／ml rhlGF．1分别干预成细胞以及分化成熟的破骨细胞，干预时间分别为：6min、20min、60mira Western．blotting检测rhlGF．1 R活化情况。 3．分别加入0、2、4、6ug／ml的兔抗。rhlGF-I IgG中和培养基中的rhlGF-I，利用Western-blotting进行抗体中和浓度的筛选。 4．重新接种成骨细胞和破骨细胞，用O、10、50、lOOnedlIll的rhlGF。1分别干预成骨细胞、破骨细胞，12小时后终止培养并收集培基，之后实验分为三组：A组：rhIGF．1直接干预组。B组：条件培养基交互培养组：破骨细胞经rhIGF．1 干预后的条件培养基(OC conditioned medium after rhlGF．1 treatment，OCCM)；成骨细胞经rhlGF．1干预后的条件培养基(OB conditioned medium after rMGF．1 treatment，OBCM)。滤过OCCM、OBCM后两细胞培基互换交互培养12h。C组：rhlGF-l中和后交互培养组：OCCM、OBCM中加入4ug／ml的抗rhlGF．I IgG，中和后再用于交互培养12h。 (1)ELISA检测各组OB上清液中RANKL、OPG及BGP含量。(2)实时荧光定量PCR检测各组OB中Bgp，Opg，RanM及OC中Ck，Mmp一9、 Rank mRNA的表达水平。结果 1．50ng／ml的RANKL诱导培养8天后，RAW264．7出现TRAP阳性多核细胞。 2．50ng／ml rMGF．1分别干预成骨细胞、破骨细胞6、20、60rain后，Western．blotting检测随着rhlGF—l干预时间的延长磷酸化rhlGF．1R的量逐渐增 II

人成骨细胞原代培养

人成骨细胞原代培养 1.人成骨细胞的分离和培养：在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为 1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2～3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。 2.酶消化法：加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。 3.组织块法：将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。传代后剩下的骨片，再加入DMEM完全培养液，37 ℃，体积分数5%CO2孵箱中孵育。如此反复两三次。

成骨细胞培养

成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。成骨细胞鉴定：

破骨细胞

破骨细胞编辑破骨细胞(osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨细胞的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase)和组织蛋白酶K（cathepsin K)是破骨细胞主要标志。目录 1定义 2形态 3作用 1定义破骨细胞(osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨细胞的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase)和组织蛋白酶K（cathepsin K)是破骨细胞主要标志。 2形态

破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell, MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个紧密堆积的核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。 3作用破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship 陷窝。在陷窝内对着骨质的一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶B和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。

成骨细胞培养问题

鄙人做成骨细胞培养检测相关指标，走了许多弯路，今将自己的总结的经验贴出，望后续战友做成骨细胞培养时少走弯路，加快实验进程，不要把过多的时间耗费在培养上！ 1.成骨细胞的取材：选取新生SD大鼠的乳鼠（有参考书上新生24h的，鄙人试过72h的乳鼠，消化下来的成骨细胞活力也是很不错的），具体取材方法不详述。 2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液，用PBS悬浮细胞，如果发现还有很多的骨片，将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化，第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀（如果担心胶原酶2会影响细胞的生长，可以将两次的悬液离心，去掉上清液后，用培养基重悬） 3.培养基问题：当时选取培养基问题确实弄苦了自己，因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM，所以也用这个，但是消化下来的细胞很难成活，后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基，消化下来的细胞完全可以成活下来。但是问题接踵而至，到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%，此时只要一换液，第二天绝对培养基混浊，没有一瓶细胞活过7天的（比如今的公司倒闭的都快），怀疑是污染问题（因为正值夏季雨天），折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用，死亡现象依然在上演。后来联系到丁香园的一个战友，他那里用的是低糖的DMEM培养基，没有出现我的问题，

成骨细胞骨形成机制

浅谈骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分子机制也逐渐得以揭示。 1成骨细胞的起源成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：(1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，cfu-f)；(2)骨祖细胞，可分化成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)

前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，调控因素主要有bmp-2，bmp-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2成骨细胞发展阶段及骨形成机制成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌?型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的调控，后者包括细胞在有丝分裂原作用下复制dna和细胞分裂的调节机制，典型的

成骨细胞骨形成机制研究解读

成骨细胞骨形成机制研究发布时间：2003-1-14 作者：童安莉陈璐璐、丁桂芝骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分子机制也逐渐得以揭示。 1 成骨细胞的起源成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种： (1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，CFU-F)；(2)骨祖细胞，可分化成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力； (3) 前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，调控因素主要有BMP-2，BMP-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2 成骨细胞发展阶段及骨形成机制成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的

浅谈体外培养成骨细胞

浅谈体外培养成骨细胞张杰（陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000）【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素；成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。 1 成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。近年来对脐血干细胞的研究越来越多。并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。此外Wan等渴。报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。 2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展

成骨细胞与破骨细胞的相互作用对骨重塑的调节

ste m cells f or treat m ent of therapy-resistant graft-versus -host disease1Trans p lantati on,2006;81(10):1390–1397 19　Bocelli-Tyndall C,B racci L,Spagnoli G et al1Bone mar2 r ow mesenchy mal str omal cells(BM-MSCs)fr om healthy donors and aut o-i m mune disease patients reduce the p r o2 liferati on of aut ol ogousand all ogeneic-sti m ulated ly mpho2 cytes in vitr o1Rheu mat ol ogy,2007;46(3):403–408 20　Gerdoni E,Gall o B,Casazza S et al1Mesenchy mal ste m cells effectively modulate pathogenic i m mune res ponse in experi m ental aut oi m mune encephal omyelitis1Ann Neur ol, 2007;61(3):219–227 21　Augell o A,Tass o R,Negrini S M et al1Cell therapy using all ogeneic bone marr ow mesenchy mal ste m cells t o p revent tissue da mage in collagen-induced arthritis1A rthritis Rheu m,2007;56(4):1175–1186 22　English A,Jones E A,Corscadden D et al1A comparative assess ment of cartilage and j oint fat pad as a potential s ource of cells f or aut ol ogous therapy devel opment in knee osteoarthritis1Rheumat ol ogy,2007;46(11),1676–1683 23　Pisati F,Boss olasco P,MeregalliM et al1I nducti on of neu2 r otr ophin exp ressi on via hu man adult mesenchy mal ste m cells:i m p licati on f or cell therapy in neur odegenerative dis2 eases1Cell Trans p lant,2007;16(1):41–55 (2009-04-14收稿) 成骨细胞与破骨细胞的相互作用对骨重塑的调节汕头大学医学院第一附属医院(515041) 陈　斌综述李学东　杜世新审校摘　要　骨骼是一个动态活性组织,它通过持续的重塑来维持其矿化平衡及自身的结构完整。在骨重塑的过程中,协调成骨细胞,骨细胞和破骨细胞之间的活性,能保持骨重塑过程的动态耦联平衡,其中成骨细胞(骨形成功能)和破骨细胞(骨吸收功能)在骨重塑过程中起关键作用。成骨细胞和破骨细胞之间的相互调节在骨重塑过程实现骨形成和骨吸收平衡的基础。两组细胞实现细胞间相互作用主要有三种方式:直接接触,分泌旁分泌因子及细胞与骨基质作用,成骨细胞和破骨细胞之间3种相互作用方式对骨重塑过程起重要调节作用。关键词　骨重塑;成骨细胞;破骨细胞骨是高活性组织,通过持续的重塑修复自身微损伤,保持结构、荷载和钙的内稳态平衡,每年有10%的骨质代谢重塑[1],骨骼系统的内稳态平衡就是靠骨重塑来实现的。骨重塑也称为骨的再生循环,人为划分为:活化,吸收,逆转及骨形成四阶段。成骨细胞(O steoblast,OB)和破骨细胞(O s2 teoclast,OC)是骨重塑过程中的两种主要细胞,协调OB与OC的生成与活性,能平衡骨的吸收与形成过程。在骨重塑过程中,OB及OC间的相互作用发生在基本多细胞单位[2],通过直接接触,分泌旁分泌因子及细胞与骨基质作用3种主要方式相互调节,进而精确影响骨的重塑过程。本文就骨重塑过程中OB与OC间的上述3种相互作用方式加以概述。 1　细胞间缝隙连接细胞间通讯缝隙连接(gap juncti on,GJ)是相邻细胞间的通道结构,GJ的主要功能是细胞与细胞间的通讯(cell-cell communicati on),又称缝隙连接细胞间通讯(gap juncti on intercellular communicati on, GJ I C)是细胞间最重要的信息交流形式,许多与生长、分化密切相关的小分子物质(﹤1000Da,如钙离子、c AMP、I P3、单糖、氨基酸、核苷酸、维生素和激素等),可以通过GJ从一个细胞至另一个细胞,从而影响组织细胞的生长、增殖、分化及迁移[3]。GJ由连接蛋白(connexin,CX)组成, CX是多基因家族成员,在人类已证实的有21种CX表达,依据分子量的不同而命名为CX26、CX40、CX43等。研究显示CX几乎表达于所有的组织细胞,不同组织可表达不同的CX,同一组织也可表达多种CX。在多细胞生物体中,细胞通过CX及介导的GJ I C以调节它们的发育和组合、控制它们的生长和增殖、协调它们的代谢和功能。因此,GJ I C是组织保持内稳态的核心。在骨骼的发育和重塑过程中GJ I C也发挥了重要的作用。研

软骨细胞培养

实验方法各种溶液的配制 1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9 （1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g （2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。（4）将酚红液（３）加入（２）中。（5）补加水至1000ml，混匀。（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。 2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml （1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。 3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml （1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。 4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。（5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。（6）过120目纱目，去除上清液。（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。

细胞培养基的基本知识

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。一、基础培养基绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取 1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM 含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

第5章软骨和骨

第五章软骨和骨[测试题] 一、单项选择题 1．透明软骨HE染色切片中难分辨纤维的原因是 A.纤维很少 B.纤维不着色 C.纤维平行排列 D.纤维短小 E.纤维与基质的折光一致 2．弹性软骨与透明软骨结构的主要区别是 A.纤维类型不同 B.纤维数量和排列不同 C.基质成分不同 D.软骨细胞分布不同 E.软骨膜不同 3．骨组织坚硬的主要原因是 A.基质内含大量骨盐 B.羟磷灰石结晶与胶原原纤维紧密结合 C.胶原纤维粗大,排列紧密 D.骨基质结构呈板层状 E.骨细胞与羟磷灰石结晶的紧密结合 4．骨板的组成是 A.平行排列的细胞 B.平行排列的细胞和骨盐 C.交叉排列的胶原纤维和骨盐 D.平行排列的胶原纤维和骨盐 E.交叉排列的胶原纤维和细胞 5．相邻骨细胞突起间有 A.桥粒

B.紧密连接 C.缝隙连接 D.中间连接 E.连接复合体 6．长骨骨干内的血管穿行于 A.骨小管内 B.中央管内 C.穿通管内 D.中央管和穿通管内 E.骨小管和中央管内 7．骨祖细胞分布于 A.骨外膜 B.骨内膜 C.骨板之间 D.骨外膜和骨板之间 E.骨外膜和骨内膜 8．有关成骨细胞以下哪项是错误的 A.体积较大,有多个核 B.胞质内粗面内质网和高尔基复合体发达 C.分泌骨基质有机成分 D.转变为骨细胞 E.排列在骨组织表面 9．骨陷窝和骨小管内除含骨细胞外还有 A.毛细血管 B.淋巴管 C.神经纤维 D.组织液 E.弹性纤维 10．长骨的间骨板位于 A.外环骨板内 B.骨单位内 C.骨单位之间 D.内环骨板内 E.骨膜下 11．类骨质是 A.无骨盐沉积的软骨基质有机成分 B.无骨盐沉积的骨基质有机成分

成骨细胞如何与破骨细胞共培养

Osteocytes as mechanosensors in the inhibition of bone resorption due to mechanical loading Lidan You a,b,c,?,Sara Temiyasathit b,c ,Peling Lee c ,Chi Hyun Kim b,c,d ,Padmaja Tummala b ,Wei Yao e,f ,Wade Kingery f,g ,Amanda M.Malone b,c , Ronald Y .Kwon b,c ,Christopher R.Jacobs b,c a Department of Mechanical and Industrial Engineering,Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering,University of Toronto,ON,Canada M533G8 b Bone and Joint Rehabilitation R&D Center,Department of Veteran ’s Affairs,Palo Alto,CA 94304,USA c Department of Mechanical Engineering,Stanford University,CA 94305,USA d Department of Biomedical Engineering,Yonsei University,Wonju,Kangwon Do,Korea e Center for Healthy Aging,Department of Internal Medicine,University of California at Davis Medical Center,Sacramento,CA 95817,USA f Physical Medicine and Rehabilitation Service,Veterans Affairs Palo Alto Health Care System,Palo Alto,CA 94304,USA g Department of Orthopedic Surgery,Stanford University School of Medicine,Stanford,CA 94305,USA Received 7October 2006;revised 30August 2007;accepted 6September 2007 Available online 26September 2007 Abstract Bone has the ability to adjust its structure to meet its mechanical environment.The prevailing view of bone mechanobiology is that osteocytes are responsible for detecting and responding to mechanical loading and initiating the bone adaptation process.However,how osteocytes signal effector cells and initiate bone turnover is not well understood.Recent in vitro studies have shown that osteocytes support osteoclast formation and activation when co-cultured with osteoclast precursors.In this study,we examined the osteocytes'role in the mechanical regulation of osteoclast formation and activation.We demonstrated here that (1)mechanical stimulation of MLO-Y4osteocyte-like cells decreases their osteoclastogenic-support potential when co-cultured with RAW264.7monocyte osteoclast precursors;(2)soluble factors released by these mechanically stimulated MLO-Y4cells inhibit osteoclastogenesis induced by ST2bone marrow stromal cells or MLO-Y4cells;and (3)soluble RANKL and OPG were released by MLO-Y4cells,and the expressions of both were found to be mechanically regulated. Our data suggest that mechanical loading decreases the osteocyte's potential to induce osteoclast formation by direct cell –cell contact.However,it is not clear that osteocytes in vivo are able to form contacts with osteoclast precursors.Our data also demonstrate that mechanically stimulated osteocytes release soluble factors that can inhibit osteoclastogenesis induced by other supporting cells including bone marrow stromal cells.In summary,we conclude that osteocytes may function as mechanotransducers by regulating local osteoclastogenesis via soluble signals.?2007Elsevier Inc.All rights reserved. Keywords:Osteocyte;Osteoclast;RANKL;OPG;Mechanotransduction Introduction It is well known that bone can adjust its structure to become better suited to withstand the mechanical demands it experi-ences.Physical loading and routine activities have been shown to inhibit bone resorption that would otherwise occur with disuse [3,8,12,26].However,the cellular mechanism underlying this phenomenon remains largely unknown.The focus of this investigation was to determine the mechanisms by which oste-ocytes might transduce and regulate bone resorption and the anti-resorptive effects of loading. Osteocytes inhabit a fluid-filled network made up of widely spaced lacunae and are interconnected via cellular processes contained within thin channels known as canaliculi.These fluid-filled lacunae and canaliculi also contain a proteoglycan-rich extracellular matrix which affects the diffusion of soluble factors released by osteocytes.Two key features of osteocytes Bone 42(2008)172– 179 https://www.360docs.net/doc/be18964633.html,/locate/bone Corresponding author.Department of Mechanical and Industrial Engineer-ing,University of Toronto,5King's College Road,Toronto,Ontario,Canada M5S 3G8.Fax:+14169787753. E-mail address:youlidan@mie.utoront.ca (L.You).8756-3282/$-see front matter ?2007Elsevier Inc.All rights reserved.doi:10.1016/j.bone.2007.09.047