第十一章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白(1)
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1.2.1 动物细胞培养 课件(中图版选修3)
继续培养，此即传代培养。
[思维激活2] 有没有不进行贴壁生长和不存在接触抑制现象 的细胞？若有，试各举一例。 提示 淋巴细胞可以持续在悬浮状态下生长；癌细胞无接 触抑制现象，在适宜条件下可以无限增殖。
3．冻存与复苏 (1)冻存 降低温度 。 保存细胞的措施主要是_________ 一般的低温 ，如哺乳动 a．短期和临时性的保存可以采用___________ 4℃左右 可存活几十天甚至几个月。 物的细胞在_________ 超低温冻存法 ，即将细胞和 b．长期保存细胞一般采用_____________ －196℃的液氮 中进行保存，在超低温环境 保护剂 放入_______________ _______ 最低点 ，近似于“_____” 休眠 状态。 中，细胞的代谢活动降到了_______ (2)复苏 当需要冻存的细胞时，随时将它们取出，迅速放入______ _____中解冻，细胞便会逐渐“_____”过来。
养瓶中会贴壁生长，形成一层细胞，相互接触后停止生长。 克隆培养法培养过程中，仅有极少数细胞的基因型会发生 改变。二倍体细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下 去了。恶性细胞系的细胞具有不死性，可以进行传代培养。
答案
D
归纳提升
动物细胞培养的选材、结果及工具酶
(1)动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官， 其细胞的分化程度较低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容 易培养。 (2)在动物细胞培养过程中，一般情况下10代以前的细胞
不同组织来源的细胞需要不同的而且也不4适宜的气体环境一般把细胞置于氧气和二氧化碳的气体环境中氧气参与细胞的二氧化碳可以维持培养葡萄糖无机盐维生素核苷酸生长因子需求量955呼吸作用ph课堂互动探究课堂互动探究热点考向示例热点考向示例随堂达标检测随堂达标检测为什么进行动物细胞培养的环境要求无菌无提示离体培养的细胞已失去了对微生物和有毒物质的防御能力一旦受到污染或自身代谢物质积累等有毒物质的侵害细胞就会死亡
高中生物新人教版选择性必修3动物细胞培养(38张)课件
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2．应用 干细胞与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有 着广泛的应用。
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第2章 细胞工程
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类型
应用
优点
造血 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起
来源于病人自
干细胞 的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
身的体细胞，
神经 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕
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第2章 细胞工程
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③不能用胃蛋白酶处理：由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4, 而胃蛋白酶发挥作用的最适pH为2.0左右，因此不能用胃蛋白酶使细胞 分散开。
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第2章 细胞工程
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(3)原代培养和传代培养：区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的 对象。 ①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细 胞后进行培养，为原代培养。 ②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制现象，用胰蛋白酶使其从瓶壁 上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
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第2章 细胞工程
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核心知识小结
4.胚胎干细胞具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一 步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 5.类似胚胎干细胞的一种细胞为诱导多能干细胞(iPS细胞)。
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第2章 细胞工程
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word部分：
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将它移植回病
干细胞 金森病、阿尔茨海默病等)
人体内后，理
可治疗小鼠的镰状细胞贫血，在治疗阿尔茨海
课件11：2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细 胞核也具有全能性．
思考题
5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出 操作过程的不同点？
多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶 牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克 隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛 的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。
用核移植的方法得到的动物称为克隆动物
核 移
胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全
能性容易
植
体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能 （难度高） 性不容易
受体细胞：MⅡ期的卵母细胞
卵母细胞采集、培养
MⅡ期卵母细胞 去核
去核卵母细胞
（二）体细胞核移植过程 （体细胞克隆动物）
供体细胞注入 去核卵母细胞
体细胞培养
植物组织培养, 植物体细胞杂交
2、动物细胞工程常用的技术手段呢？ • 动物细胞培养、动物细胞核移植、 • 动物细胞融合、生产单克隆抗体等
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
一、动物细胞培养 （一）概念
从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞， 然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
（三）培养条件
1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、血清、血浆等。）
合成培养基
保证细胞顺利
3、温度和pH
的生长增殖
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
4、气体环境：
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
思考
动物细胞培养液的主要成分是什么？ 较植物组培培养基有何独特之处？ 主要成分： 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量 元素、血清、血浆等。
思考题
5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出 操作过程的不同点？
多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶 牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克 隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛 的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。
用核移植的方法得到的动物称为克隆动物
核 移
胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全
能性容易
植
体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能 （难度高） 性不容易
受体细胞：MⅡ期的卵母细胞
卵母细胞采集、培养
MⅡ期卵母细胞 去核
去核卵母细胞
（二）体细胞核移植过程 （体细胞克隆动物）
供体细胞注入 去核卵母细胞
体细胞培养
植物组织培养, 植物体细胞杂交
2、动物细胞工程常用的技术手段呢？ • 动物细胞培养、动物细胞核移植、 • 动物细胞融合、生产单克隆抗体等
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
一、动物细胞培养 （一）概念
从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞， 然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
（三）培养条件
1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、血清、血浆等。）
合成培养基
保证细胞顺利
3、温度和pH
的生长增殖
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
4、气体环境：
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
思考
动物细胞培养液的主要成分是什么？ 较植物组培培养基有何独特之处？ 主要成分： 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量 元素、血清、血浆等。
动物细胞与组织培养
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
传代培养
动物细胞生长特性：
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，
称为细胞贴壁。 要求：
培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂 增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
细胞贴壁过程
3.有关概念:
注意： ①概念理解：原代培养、传代培养、细胞株 、 细胞系 ②胰蛋白酶处理的原因、目的和注意事项 ③动物细胞培养和植物组织培养的区别
思考与探究：
如何用细胞培养技术，为烧伤病 人植皮？
取该患者的皮肤进行 细胞培养,获得足量的细 胞后再移植
课堂反馈练习
1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 --------------------（A ）
多细胞动物和人体的细胞 都生活在内环境中，根据你所 学的知识，认为体外培养细胞 应该模拟内环境的哪些内容呢？
动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、必须的营养物质 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、核酸、 嘌呤、嘧啶、激素、生长因子、动物血清等。）
3、适宜的温度 36.5+（-）0.5度
包权
人书友圈7.三端同步
动物细胞培养
1、概念（人教版） 动物细胞培养就是从动物机体中取出
相关的组织，将它分散成单个细胞，然后， 放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和 繁殖。
讨论
1、动物细胞培养的原理是什么？
2、从动物机体中要取出哪些相关组织？并 解释原因。
3、组织分散成单个细胞的方法是什么？ 其理论依据是什么？
D．培养至50代后继续传代的细胞是细胞株
第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿ppt课件
• 单克隆抗体（McAb）的应用：
• 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 • 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血 吸虫等数百种疾病的诊断。 • 在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能 识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便 与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制 成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部 位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 • 与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优 点。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功
融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代
病毒诱导动物细胞融合。
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1
一、动物细胞融合技术
•Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无 脊椎动中发现了细胞合并现象。 •1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触 发动物细胞融合的效应。 •1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG） 化学融合法。
•1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细 胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤 细胞。 •20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此 时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
细胞工程习题 第十一章
第十一章 复习题 一、微载体与生物反应器结合在实现动物细胞大规模培养方面有怎样的优势？ 微载体（Microcarrier）：是直径60-250μm的适用于贴避依赖型细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。微载体与生物反应器结合在实现动物细胞大规模培养方面有以下优势： 1.模拟了体内三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。 2.很好地解决了生物反应器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。 3.把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反应器。 4.接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。
二、分析讨论动物细胞生物制药的优点与存在的问题。 动物细胞生物制药的优点： 1、多半可分泌到细胞外，提取纯化方便； 2、蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。 动物细胞生物制药存在的问题： 1、细胞密度低，产物浓度低； 2、大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低； 3、动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力； 4、目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺； 5、在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。
三、举例说明动物细胞培养在生物制药中的应用。 《用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗》 方法：搅拌式生物反应器培养Vero细胞，待细胞在微载体上长成单层后，用狂犬病毒aG株感染细胞。培养5d后，打开灌流收获病毒液，每天取样测定病毒滴度。经灭活后制备成试验疫苗，进行效力试验。 结果：3次培养，细胞密度均达到1X106/mL以上，病毒滴度都在106LD50以上，3批试验疫苗的效价分别达到5.88、6.49和5.98IU/mL。 结论：在生物反应罐中用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗工艺合理，所获免疫原形良好，适用于工业化生产，有较好的应用前景。
工程动物细胞培养制药工艺过程
胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。
在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白， 有利于纯化。
细胞特异性糖基化途径——淋巴细胞中进行，它不依赖于 内质网和高尔基体。
IgG的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该 糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。
IgG蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖 基化。
0 ＋＋＋ ＋0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
复合体
0 － － ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋
产物浓度 分子量 二硫键 分泌 形式 折叠 糖基化 逆转录病毒 热原 培养特点 分离纯化
大肠杆菌 高 低 有限 无 包涵体 不正确 无 无 可能 容易 复杂
酵母 高 高 不受限制 有或无 单链，天然 正确 可能 无 无 容易 复杂
研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；
决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。
第二节 基因工程动物细胞系的构建
构建高效表达载体 转染动物细胞 筛选鉴定 获得生产用工程化细胞系
动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。
病毒载体：
逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原 始病毒改造而来。
糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的 位点和数量及糖的种类都不同。
N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体 的保守序列为Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨 基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影 响，而第三位Thr能增强糖基化。
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动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低， 产量远远落后于其他表达系统。
在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白， 有利于纯化。
细胞特异性糖基化途径——淋巴细胞中进行，它不依赖于 内质网和高尔基体。
IgG的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该 糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。
IgG蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖 基化。
0 ＋＋＋ ＋0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
复合体
0 － － ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋
产物浓度 分子量 二硫键 分泌 形式 折叠 糖基化 逆转录病毒 热原 培养特点 分离纯化
大肠杆菌 高 低 有限 无 包涵体 不正确 无 无 可能 容易 复杂
酵母 高 高 不受限制 有或无 单链，天然 正确 可能 无 无 容易 复杂
研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；
决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。
第二节 基因工程动物细胞系的构建
构建高效表达载体 转染动物细胞 筛选鉴定 获得生产用工程化细胞系
动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。
病毒载体：
逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原 始病毒改造而来。
糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的 位点和数量及糖的种类都不同。
N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体 的保守序列为Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨 基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影 响，而第三位Thr能增强糖基化。
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动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低， 产量远远落后于其他表达系统。