黑曲霉发酵生产α-淀粉酶

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶摘要本实验通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶，发酵周期为66h。

每隔6h取一次样，对发酵罐发酵过程的特征参数进行了初步研究，分析了生物量、pH值、残糖含量、酶活力的变化，并绘制出变化曲线，从而得到黑曲霉生产α-淀粉酶过程中理化性质的变化。

关键词黑曲霉发酵α-淀粉酶特征参数Abstract The test were undertaken to use aspergillus niger to produce α-amylase. The whole fermentation period was 66 hours. Sampled every 6 hours to preliminary study on the characteristic parameters of fermentation process in the fermentation tank. The biomass, pH, concentration of glucose, enzyme activity were measured and the varied curves were also described. So could we obtain the changes of the physicochemical properties of fermentation process.Key words Aspergillus niger fermentation α-amylase characteristic parameters前言α-淀粉酶(α-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶)普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶。

它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[1]。

α-淀粉酶水解所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。

1963年日本研究者Yasuji Minoda[2]发现黑曲霉可以生产耐酸性α-淀粉酶，此后，然后美国、韩国、中国等国家都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。

陆续发现枯草杆菌、河内氏曲霉(A. Kawachii)、青霉、酵母等都可以产生耐酸性α-淀粉酶[3-4]。

耐酸性α-淀粉酶与中性α-淀粉酶对淀粉的作用机制相似，但是在低pH条件下，完成其上述作用过程，即以随机方式切断淀粉分子内的α-1,4糖苷键，不能水解支链淀粉的α-1,6糖苷键，可以水解含有3个或3个以上α-1,4糖苷键的低聚糖[3]。

耐酸性α-淀粉酶突出的特点是对酸的稳定性明显高于中性α-淀粉酶。

一般中性α-淀粉酶活的最适pH为6~7，而耐酸性α-淀粉酶活的最适pH为4~5[4]。

耐酸性α-淀粉酶的酸稳定性明显高于中性α-淀粉酶。

但是，与中性α-淀粉酶相比，耐酸性α-淀粉酶对碱性条件则更为敏感[5]。

本实验通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。

初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。

整个实验按照“菌种的培养→空消→实消→接种→发酵→放罐”的发酵过程进行。

在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。

最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料与试剂原料：黑曲霉。

药品与试剂：淀粉、蔗糖、柠檬酸氢二铵、KH2PO4、CaCl2、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂(植物油)、I2、KI、磷酸缓冲液(pH 6.0)、0.05%淀粉液、稀碘液、浓硫酸、蒽酮、0.1 g/L的葡萄糖溶液、蒸馏水等。

主要仪器和设备：5 L搅拌式发酵罐、离心机、分光光度计等。

1.1.2 培养基发酵培养基配方：可溶性淀粉75 g，蔗糖75g，柠檬酸氢二铵80 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 g，MgSO44·7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH 5.0，消泡剂(植物油)3 mL。

1.2 方法1.2.1 发酵实验步骤1.2.1.1 空消先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：(1) 先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。

(2) 蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。

(3) 再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统(两边)。

(4) 罐压升至所需温度(121 ℃)时开始计时，保温保压30 min。

(5) 结束空消：逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。

同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。

近罐空气阀的尾阀要一直微开启。

1.2.1.2 种子制备接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。

1.2.1.3 培养基配制、实消按照配方配制发酵培养基，然后进行实消。

闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽(方法同空消)→罐压升至0.12 MPa(121 ℃)，保压、保温30分钟→实消结束。

1.2.1.4 冷却接种与发酵待培养基冷却至28 ℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。

将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。

1.2.2 发酵参数检测1.2.2.1 pH的测定标准液校准pH计后，测定样品pH值。

1.2.2.2 生物量的测定每次取10 mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 10 min)离心，收集上清液用来测酶活和残糖(5000 rpm上清直接测残糖，再取出1mL，10000rpm离心后的上清测酶活)，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100 ℃烘箱中，烘干(2 h左右)，然后测其干重，取平均值。

1.2.2.3 酶活的测定取5mL 0.05 %的可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液)的酶液0.5 mL，反应5 min后，用5 mL 0.1 mol/L H2SO4终止反应。

取0.5 mL反应液与5 mL稀碘液显色，在620 nm处测光密度。

以0.5 mL水代替0.5 mL反应液为空白(用来调零调百)，以不加酶液(加同样体积的缓冲液)的管为对照(即取5mL 0.5 %的可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中预热10 min，然后加入6.0的磷酸盐稀释缓冲液0.5 mL，反应5 min后，用5mL 0.1 mol/L H2SO4终止反应。

取0.5 mL反应液与5 mL稀碘液显色。

由于实验组样品内含有淀粉因此一开始测出来的实验组颜色深于对照组无法测OD值，因此加入了扣除组：取0.5 mL磷酸盐稀释缓冲液，在40 ℃水浴中预热10 min，加0.5 mL的酶液，反应5 min后，用5 mL 0.1 mol/L H2SO4终止反应。

以此作为扣除组。

酶活力根据下式计算：酶活力(U/mL)＝(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。

调整D使(R0-R)/R0在0.2~0.7之间。

确定在40 ℃、5 min内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。

1.2.2.4 残糖量的测定(1) 标准曲线的测定分别取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL，用蒸馏水补到1.00 mL，分别加入4.00 mL蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。

自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min，冷却后进行比色。

以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。

(2) 样品含量测定的测定取糖浓度为50 μg/mL左右的样品溶液1.00 mL，一式3份分别置于不同试管中，对照加入1.0 mL蒸馏水，然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。

根据标准曲线和样品浓度计算含量。

2 结果与分析2.1 PH值图1表示发酵过程中pH值随发酵时间变化曲线图。

总体趋势下，pH 值随着发酵时间的增加而逐渐下降。

在0—12h内PH值趋于稳定；在12—30h 内变化幅度加大；在30—48h内PH值稳定不变；在48—54h内又有小幅度下降；在54—66h内PH值再次趋于稳定。

可能的原因在于在发酵初期，黑曲霉代谢较弱，即延迟效应，因而变化幅度较小；随着菌种的活化，菌株的新陈代谢能力增强，CO2的释放以及糖浓度的降低使得发酵液的pH值逐渐下降，且变化幅度较大；发酵后期，菌种的活力下降，溶液的各理化性质趋于稳定，因而pH值保持在4.5左右，且变化幅度平稳。

图1、发酵罐中PH值变化曲线2.2 生物量图2表示发酵过程中生物量随发酵时间变化曲线图。

从图上可以明显地看出生物量整体上是呈上升趋势，但数据波动较大，可能是实验过程中操作失误所导致的。

图2、发酵罐中生物量变化曲线2.3 酶活力图3表示发酵过程中酶活力随发酵时间变化曲线图。

总体上酶活力随着发酵时间逐渐变强，在0—42h内酶活力变化较为缓慢，这可能是发酵初期菌种数量过少且菌种进入新环境中需要一定的时间去适应环境；42—60h阶段，酶活力迅速上升，这段时期菌种应该处于对数期，菌种数量大幅度增加且活性最大；最后6h酶活力增长速度减缓，应该是发酵液中营养物质减少，菌种进入减速期。

图3、发酵液中酶活力的变化曲线2.4 残糖量图4 为葡萄糖标准曲线图。

图5 表示发酵过程中糖残量随发酵时间变化曲线图。

残糖量总体上随时间变化而减少，但是数据变动不符合逐渐减小的规律，这应该是在测量过程中操作及仪器造成的误差。

图4、葡萄糖标准曲线0.20.40.60.811.21.41.61.8010203040506070时间残糖图5、残糖量随发酵时间变化曲线3 讨论本实验主要通过检测pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。

由于实验过程中通气量较小，影响了菌株的生长繁殖，表现在酶活力、残糖量和生物量不同程度的偏小。

本实验初步探究了黑曲霉生产α-淀粉酶的生产工艺，为了提高酶活力等参数，可以通过优化培养基成分和培养条件来提高；另外还可以通过诱变的方法获得高产菌株，从而可在发酵过程中获得更高产量。