基因芯片制造技术的比较研究

基因芯片制造技术的比较

摘要：基因芯片是电子学和生命科学相结合的产物，和计算机芯片有着奇妙的相似性，也储藏着极其丰富的信息量。基因芯片也称作DNA微阵列，目前制备芯片主要以玻璃片或者硅片为载体，采用原位合成和微距阵的方法将寡聚甘酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上【2】。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地讲探针防止到芯片上的指定位置。基因芯片主要包括芯片的制备、样品制备、生物分子反应、芯片信号的检测。本文主要从芯片的样品的制造入手，分析其常见的制备技术及优劣特性【3】。

关键词：基因探针，基因芯片，制造技术

一引言

基因芯片从实验室走向工业化直接得益于探针固相原味合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成(in situ synthesis)与合成点样两种【3】。原位合成法主要以光引导聚合技术(light-directed synthesis)和压电打印技术(piezoelectric printing)为主；合成点样主要是借助传统的DNA或多肽固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。

二芯片技术要点

2.1芯片技术的基本要点

芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。

2.1.1芯片制备

目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。

2.1.2样品制备

生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。

2.1.3杂交反应

杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。

2.1.4信号检测和结果分析

杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作【3】。

三主要制造技术

3.1原位合成DNA微阵列光引导聚合技术是原位合成的主要技术，它是照相平板印刷技术与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。

光引导聚合技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106个/㎝2的微探针排列密度，能够在一片6厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。并且其不仅可以用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。目前的基因芯片按用途可分为三大类，分别为基因表达分析芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片，基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司，可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域；疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断，包括各种遗传病和肿瘤等【2】

3.2压电打印技术(piezoelectric printing)。其装置与普通的彩色喷墨打印机无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类

的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术【3】。

3.3微量点样DNA微阵列制造技术。微量点样技术是目前大部分基因芯片公司使用的流行方法。就是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列并固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通过类似于northern,southern的方法与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的大量信息，进行基因的高

通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究

3.4其他。除了以上三种常用技术以外，还有一种毛细管微流泵芯片，在边长2英寸的芯片上集成了(144个微室，分别由流入孔、反应室、循环管和废液流出孔组成，这种芯片不但可以用于基因诊断和分析，还可用于合成化学，就象一个微小的自动生化分析仪【2】

四制造技术的优劣分析

4.1光引导聚合技术的优缺点

4.1.1光引导聚合技术的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成48 （65536 ）个探针的8 聚体寡核苷酸序列仅需4 × 8=32 步操作，8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。

4.1.2光引导聚合技术的主要缺点是合成反应每步产率比较低，不到95% 。而通常固相合成反应每步的产率在99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到1010/cm2

4.2压电打印技术

4.2.1压电打印技术的主要优点是此种方法可以合成长度达到40至50个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到99％以上。

4.2.2压电打印技术的主要缺点是通过原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因