第十四章PCR核酸扩增仪PPT课件
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PCR专题 ppt课件
pre-denaturation-denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中 写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车 行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来 的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段， 该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使 得自动化。
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应： • X=X0*2n •非理想的PCR反应： • X=X0 (1+Ex)n • • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
PCR process
Principle of PCR
PCRPPT课件
13
第一步叫“变性”，把样品加热到94-96℃一到
数分钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。 第二步叫“退火”，让样品的温度下降到50-
65℃一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。
14
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.......GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt
重复上述的三步循环反应，PCR扩增产物量将呈 指数积累。
由于经过一个循环反应合成的产物又将成为下一 个循环反应的底物，经过n次循环反应后，特 异性靶DNA的拷贝数将扩增2n倍。
11
假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG........... GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT........... ...........ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC ...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
5
6
DNA的性质
▪ DNA变性：DNA分子在热、酸碱或一些化学试 剂条件下由双链变成单链的过程。
▪ DNA的复性：变性的DNA两条互补单链，在适 当条件下重新缔合成双链的过程为复性。
▪ 核酸分子杂交：两条来源不同的，具有互补关系 的核酸单链在一定条件下按碱基配对的原则形成 异质双链的过程。
7
DNA 热变性及复性
2
特定基因的扩增方法
▪ 通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数 的质粒载体分子上并转化到适当的受体细胞，在 体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝 数也得到了有效的扩增。
▪ 在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关 细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保 卫基因产生明显的扩增。
第一步叫“变性”，把样品加热到94-96℃一到
数分钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。 第二步叫“退火”，让样品的温度下降到50-
65℃一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。
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TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.......GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt
重复上述的三步循环反应，PCR扩增产物量将呈 指数积累。
由于经过一个循环反应合成的产物又将成为下一 个循环反应的底物，经过n次循环反应后，特 异性靶DNA的拷贝数将扩增2n倍。
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假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG........... GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT........... ...........ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC ...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
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DNA的性质
▪ DNA变性：DNA分子在热、酸碱或一些化学试 剂条件下由双链变成单链的过程。
▪ DNA的复性：变性的DNA两条互补单链，在适 当条件下重新缔合成双链的过程为复性。
▪ 核酸分子杂交：两条来源不同的，具有互补关系 的核酸单链在一定条件下按碱基配对的原则形成 异质双链的过程。
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DNA 热变性及复性
2
特定基因的扩增方法
▪ 通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数 的质粒载体分子上并转化到适当的受体细胞，在 体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝 数也得到了有效的扩增。
▪ 在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关 细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保 卫基因产生明显的扩增。
实验四 PCR扩增目的基因课件PPT
engineering of DNA
• 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence
variations
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PCR反应中的成份
1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所 决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验四 PCR扩增目的基因
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1
实验二 PCR扩增目的基因
【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了
6
3. PCR管内加好上述试剂之后要充分混合，然后离心数 秒，放入PCR仪上。
4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪， 电泳。
PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行 电泳分析，检查反应产物及长度。
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电泳结果如图所示
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[注意] 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
• 体外程序化的DNA合成技术。
devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下， 以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
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反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
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反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
PCR 技术及应用ppt课件
个体识别与亲子鉴定 GMO
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PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
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33
RT-PCR图解
学习交流PPT
34
• 三、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR)
•
该法的基本原理是在基因未知序列端添加同
聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用
人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，
在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。
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四、反向PCR (inverse PCR, IPCR)
学习交流PPT
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PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
• 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
• 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩 增条带。
• 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
PCR原理ppt课件
1. 长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下。 长片段PCR扩增存在的问题： （1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低 （2）高温会损坏模板DNA和PCR产物 （3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 （4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
PCR原理及其操作PPT课件
精选PPT课件
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① 变性温度与时间：
• 一般93℃～94℃，1min足以使模板 变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的
活性有影响。
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② 退火(复性)温度与时间：
• 退火温度是影响PCR特异性的重要 因素
• 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列 的长度
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右；
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上 的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；
④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的 互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；
• 复性时间一般为30～60s，足以使引 物与模板之间完全结合
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③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200µmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜;
• Mg2+浓度过高，反应特异性降低，
出现非特异扩增， 浓度过低会降低
Taq DNA聚合酶的活性，使反应产
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
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PCR 循环 – PCR技术的原理
第一步 – 加热变性
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PCR 循环- PCR技术的原理
第二步 – 引物与模板DNA分子退火
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PCR 循环- PCR技术的原理
第三步 - 引物延伸
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PCR技术的原理
第1个 PCR 循环完成后 ——得到两个拷贝的靶序列
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PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解
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荧光基团和淬灭荧光基团分离
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❖ 每扩增一条DNA链，
就有一个荧光分子形成，
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PCR.swf原理flash
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❖ Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
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Ct值与起始模板的关系
❖ 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
❖ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的 对数，纵坐标代Ct值。
❖ 5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高， 有非常严密的数学理论支持。
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第二节 PCR扩增仪的结构和工作原理
❖ 普通定性PCR扩增仪 ❖ 实时荧光定量PCR扩增仪
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PCR扩增仪的工作原理
❖ PCR核酸扩增仪：利用PCR技术对特定基因做体 外的大量扩增
❖ PCR核酸扩增仪工作的关键是：温度控制
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为 荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：
threshold = 10 × SDcycle 6-15
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15
Ct 值的定义
❖ 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要 的概念 —— Ct值。
❖ C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
实时荧光定量PCR
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实时荧光定量PCR的特点
❖ 1.特异性强
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性， 故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
❖ 2.灵敏度高
灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达 102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病 原体的数目为0-1010/拷贝。
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PCR技术的原理
循环数 扩增产物量 （2n）
1
21＝2
2
22＝4
3
23＝8
4
24＝16
5
25＝32
6
26＝64
20
220＝1,048,576
30
230＝1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
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实时荧光定量PCR技术原理
❖ 实时荧光定量PCR技术:实时荧光定 量PCR技术是在普通PCR技术基础上 增加了实时荧光指示系统。
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PCR扩增仪的控温方式
控温方式
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气 加热控温
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普通定性PCR扩增仪
❖ 按照变温方式分为以下三类：
水浴式PCR扩增仪 变温金属块式PCR扩增仪 变温气流式PCR扩增仪
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——水浴式PCR仪
一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。
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荧光定量PCR的特点
❖ 3.重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的 CT值相同，但其产物的荧光量却相 差甚大。因为域值设置在指数扩增 期，在此阶段，各反应组分浓度相 对稳定，没有副作用，CT与荧光信 号的对数呈线性关系。
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荧光定量PCR的特点
❖ 4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的 机率。
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Hale Waihona Puke 18因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
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TaqMan荧光探针
❖PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基团和一个淬灭荧光基 团。
采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行 水浴温度的测量、显示和控制
并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的 置放以及槽间的移动。
特点：变温快、时间准、温度均一，但仪器体积较 大，自动化程度低，控温不稳定，目前国内应用较 少。
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——变温金属块式PCR仪
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❖ 探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。
❖ PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶 活性将探针酶切降解，荧光基团和 淬灭荧光基团分离。
❖ 实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。
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注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收
在PCR反应体系中加入荧光探针 基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
探针
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实时荧光定量PCR
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荧光域值（threshold）的设定
PCR 核酸扩增仪
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教学基本要求
❖ 掌握核酸扩增仪的分类和工作原理。 ❖ 掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。 ❖ 掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。 ❖ 掌握PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实
时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。
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内容提要
第一节 PCR扩增仪工作原理 第二节 PCR核酸扩增仪的分类与结构 第三节 PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规
程及常见故障的排除 第四节 PCR核酸扩增仪的临床应用
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第一节 PCR核酸扩增仪的工作原理
❖ PCR技术的原理 ❖ 实时荧光定量PCR技术的原理
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PCR技术的原理
❖ PCR技术的本质是核酸体外扩增
加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引 物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶， dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸 引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至 25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸 拷贝数。
PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
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PCR 循环 – PCR技术的原理
第一步 – 加热变性
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PCR 循环- PCR技术的原理
第二步 – 引物与模板DNA分子退火
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PCR 循环- PCR技术的原理
第三步 - 引物延伸
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PCR技术的原理
第1个 PCR 循环完成后 ——得到两个拷贝的靶序列
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PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解
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荧光基团和淬灭荧光基团分离
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❖ 每扩增一条DNA链，
就有一个荧光分子形成，
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PCR.swf原理flash
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❖ Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
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Ct值与起始模板的关系
❖ 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
❖ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的 对数，纵坐标代Ct值。
❖ 5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高， 有非常严密的数学理论支持。
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第二节 PCR扩增仪的结构和工作原理
❖ 普通定性PCR扩增仪 ❖ 实时荧光定量PCR扩增仪
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PCR扩增仪的工作原理
❖ PCR核酸扩增仪：利用PCR技术对特定基因做体 外的大量扩增
❖ PCR核酸扩增仪工作的关键是：温度控制
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为 荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：
threshold = 10 × SDcycle 6-15
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Ct 值的定义
❖ 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要 的概念 —— Ct值。
❖ C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
实时荧光定量PCR
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实时荧光定量PCR的特点
❖ 1.特异性强
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性， 故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
❖ 2.灵敏度高
灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达 102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病 原体的数目为0-1010/拷贝。
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PCR技术的原理
循环数 扩增产物量 （2n）
1
21＝2
2
22＝4
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23＝8
4
24＝16
5
25＝32
6
26＝64
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220＝1,048,576
30
230＝1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
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实时荧光定量PCR技术原理
❖ 实时荧光定量PCR技术:实时荧光定 量PCR技术是在普通PCR技术基础上 增加了实时荧光指示系统。
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PCR扩增仪的控温方式
控温方式
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气 加热控温
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普通定性PCR扩增仪
❖ 按照变温方式分为以下三类：
水浴式PCR扩增仪 变温金属块式PCR扩增仪 变温气流式PCR扩增仪
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——水浴式PCR仪
一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。
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荧光定量PCR的特点
❖ 3.重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的 CT值相同，但其产物的荧光量却相 差甚大。因为域值设置在指数扩增 期，在此阶段，各反应组分浓度相 对稳定，没有副作用，CT与荧光信 号的对数呈线性关系。
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荧光定量PCR的特点
❖ 4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的 机率。
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Hale Waihona Puke 18因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
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TaqMan荧光探针
❖PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基团和一个淬灭荧光基 团。
采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行 水浴温度的测量、显示和控制
并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的 置放以及槽间的移动。
特点：变温快、时间准、温度均一，但仪器体积较 大，自动化程度低，控温不稳定，目前国内应用较 少。
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——变温金属块式PCR仪
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❖ 探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。
❖ PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶 活性将探针酶切降解，荧光基团和 淬灭荧光基团分离。
❖ 实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。
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注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收
在PCR反应体系中加入荧光探针 基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
探针
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实时荧光定量PCR
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荧光域值（threshold）的设定
PCR 核酸扩增仪
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教学基本要求
❖ 掌握核酸扩增仪的分类和工作原理。 ❖ 掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。 ❖ 掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。 ❖ 掌握PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实
时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。
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内容提要
第一节 PCR扩增仪工作原理 第二节 PCR核酸扩增仪的分类与结构 第三节 PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规
程及常见故障的排除 第四节 PCR核酸扩增仪的临床应用
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第一节 PCR核酸扩增仪的工作原理
❖ PCR技术的原理 ❖ 实时荧光定量PCR技术的原理
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PCR技术的原理
❖ PCR技术的本质是核酸体外扩增
加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引 物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶， dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸 引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至 25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸 拷贝数。