酶抑制剂筛选模型研究进展
基于他克林的乙酰胆碱酯酶抑制剂的3D-QSAR+研究及虚拟筛选
２期
月苟绍华，等：水溶性
ＡＭ
／ＡＡＣｈ／ｅＡｍＯ化ｉｃＣａｌＡ学Ｒ／ｅＤｓ研ｅＡａｒＮ究ｃｈＡａ与ｎ四ｄ 元Ａ应ｐ共ｐｌ用ｉｃ聚ａｔｉ物ｏｎ 驱油剂的合成及性能研究ＶＦｏｅｌ．ｂ２．６，，２Ｎ０１ｏ４．２
文章编号：１００４ －１６５６ （２０１４ ）０２ －０２４１ －０９
第２ 期
王文鹃，等：基于他克林的乙酰胆碱酯酶抑制剂的 ３Ｄ－ＱＳＡＲ 研究及虚拟筛选
２４３
则将 ５８ 个 分 子 分 为 训 练 集 （ ４９ 个 ） 和 测 试 集 （９ 个），５８ 个分子的结构和活性如表 １ 所示。
表 １ 乙酰胆碱酯酶抑制剂分子结构和活性值
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＡＣｈＥ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
２４２
化学研究与应用
第 ２６ 卷
阿尔茨海默病（ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ摧ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ） 俗称 老年痴呆症，是一种中枢神经系统变性病，是老年 期痴呆最常见的一种类型。 主要表现在渐进性记 忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神 经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。
由于 ＡＤ 的病因和发病机制尚不明确，目前没 有特效方法逆转和阻止病情发展，但早期的对症 治疗，包括药 物 治 疗、 心 理 治 疗 和 良 好 的 护 理， 对 延缓患者生活质量减退十分重要。 研究发现 与 ＡＤ 发病 相 关 的 因 素 有 β淀 粉 样 蛋 白 （ Ａβ） 沉 积［１］ 、氧化应激、生物金属离子稳态失衡以及低水 平的乙酰胆碱（ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ，Ａｃｈ） ，基于这些因素 提出了几种试图解释 ＡＤ 病发病机理的学说［２，３］ 。 其中，最典型的是中枢胆碱能损伤学说，它是目前 较为公认的阿尔茨海默病的发病机制，是 ＡＤ 治疗 获得有限疗效的重要基础。 该学说认为胆碱能神 经递质是脑组织中的重要化学物质，发生阿尔茨 海默病时脑内的胆碱能神经元减少，导致乙酰胆 碱（ ＡＣｈ） 合成、储存和释放减少，进而引起以记忆 和识别功能障碍为主要症状的一系列临床表现。 因此，维持和恢复 Ａｃｈ 水平可以减轻 ＡＤ 病的症 状 。 ［４，５］ 乙 酰 胆 碱 酯 酶 （ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ， ＡＣｈＥ ） ，主要分布于神经组织，其经典功能是 水 解 神经递质乙酰胆碱（ ＡＣｈ），从而终止神经冲动的 传递。 阿尔茨海默病可以通过 ＡＣｈＥ 抑制剂抑制 ＡＣｈＥ 的活性，提高 ＡＣｈ 在大脑中的水平，提高病 人的记忆力［６］ 。 ＡＣｈＥ 抑制剂［７］ 已经成为 ＡＤ 患 者的 首 选 药 物， 代 表 药 物 主 要 有 他 克 林 （ Ｔａｃ－ ｒｉｎｅ） ［８］ 、多奈哌齐（ Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ） ［９］ 、利 斯的明（ Ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、加兰他敏（ Ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ） 以 及石杉碱甲（ Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ Ａ）。 其中，他克林是第一 个 ＦＤＡ 批准上市的治疗 ＡＤ 病的药物，但他克林 会引起肝毒性及消化道不良反应，因此其应用受 到了限制。 尽管如此，他克林仍被作为骨架广泛 的应用于开发具有额外生物特性的多功能 ＡＣｈＥ 抑制剂［１０－１３］ 。 为此，人们设计和合成了大量他克 林改性衍生物，力图从中找到选择性更高、毒副作 用较小、综合性能优于他克林的新乙酰胆碱酯酶 抑制剂。
药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究
药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究药物代谢酶抑制剂是一类能够抑制体内药物代谢酶活性的药物。
通过抑制药物代谢酶活性，可以提高体内药物的生物利用度，延长其血浆半衰期，从而增加疗效和减少副作用。
因此，药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究具有重要的临床意义。
一、药物代谢酶抑制剂筛选的方法和原理药物代谢酶抑制剂筛选的方法多种多样，主要包括体外筛选和体内筛选两种。
1. 体外筛选方法体外筛选方法主要利用酶促反应体系，通过测定药物代谢酶的底物转化率或产物生成速度的变化来评估药物的抑制活性。
常用的体外筛选方法包括酶抑制试验、酶活性测定、酶结合实验等。
酶抑制试验是最常用的体外筛选方法之一，它通过在反应体系中添加不同浓度的待测化合物，观察其对药物代谢酶催化作用的抑制程度。
常用的底物包括双氢可酮、非那根、苯妥英等。
酶抑制试验通常可以通过计算半抑制浓度（IC50）来评价药物的抑制活性。
2. 体内筛选方法体内筛选方法是基于动物模型进行的，常用的方法包括小鼠或大鼠系列、猪系列等。
在体内筛选中，通过给动物灌胃或静脉注射待测化合物，然后测定药物的药代动力学参数（如血浆浓度-时间曲线）来评估其抑制活性。
通过比较药物代谢酶抑制剂组与对照组的药代动力学参数，可以判断待测化合物是否具有抑制活性。
药物代谢酶抑制剂的筛选原理主要依据于药物在体内的药动学过程。
药物在体内经过吸收、分布、代谢和排泄等过程，其中代谢是药物被机体代谢酶转化为活性代谢产物或无活性代谢产物的关键环节。
如果能够通过抑制药物代谢酶的活性，减少或延长药物的代谢速度，就可以改变药物的药效和毒性。
二、药物代谢酶抑制剂的药代动力学研究药代动力学研究是对药物在体内代谢过程的定量分析和评估。
药物代谢酶抑制剂的药代动力学研究主要包括体内药物动力学参数的测定和药物相互作用的评估。
1. 体内药物动力学参数的测定体内药物动力学参数包括药物的血浆浓度-时间曲线、药物的消除半衰期、清除率等。
酶抑制剂的定量构效关系和分子模拟研究
酶抑制剂的定量构效关系和分子模拟研究酶抑制剂的定量构效关系和分子模拟研究引言：酶抑制剂是一类能够干扰生物体内特定酶的活性的化合物。
通过与酶发生特定的相互作用，酶抑制剂能够抑制酶的活性，从而干扰正常的生物过程。
酶抑制剂的研究对于药物开发和治疗疾病具有重要的意义。
在药物开发领域，深入理解酶抑制剂的构效关系以及分子模拟研究可以为药物设计和优化提供重要的指导和参考。
一、酶抑制剂的定量构效关系1.1 酶抑制剂的构效关系是指酶抑制剂的结构与其生物活性之间的关系。
在药物设计中，研究酶抑制剂的构效关系能够通过系统的改变其结构，从而优化其活性和选择性。
1.2 酶抑制剂的构效关系可以通过定量构效关系（QSAR）模型来进行研究。
QSAR模型能够定量地描述酶抑制剂的结构与活性之间的关系，从而预测和优化酶抑制剂的活性。
二、分子模拟研究在酶抑制剂研究中的应用2.1 分子模拟是一种通过计算机模拟酶抑制剂与酶的相互作用来研究酶抑制剂的结构和活性的方法。
2.2 分子模拟研究可以通过计算酶抑制剂和酶的相互作用力，预测酶抑制剂与酶的结合能力，从而更好地优化酶抑制剂的设计。
2.3 分子模拟研究还可以通过计算酶抑制剂与酶的三维结构，揭示酶抑制剂的结构特征和活性位点的结构要求，为药物设计提供重要的启示。
三、实例：分子模拟研究酶抑制剂的例子3.1 以某种特定酶为靶点，利用分子模拟方法筛选一批酶抑制剂候选化合物。
3.2 通过计算候选化合物与酶的相互作用力，筛选出与酶结合能力较强的酶抑制剂。
3.3 通过分析候选化合物与酶的三维结构，探索酶抑制剂的构效关系，并结合QSAR模型预测酶抑制剂的活性。
结论：酶抑制剂的定量构效关系和分子模拟研究在药物研发中起着重要的作用。
通过研究酶抑制剂的构效关系，可以帮助我们理解其生物活性的来源，从而优化药物的设计。
分子模拟研究则可以通过计算和模拟酶抑制剂与酶的相互作用，为药物设计提供重要的指导和参考。
未来的研究中，我们需要进一步发展和改进分子模拟方法，提高其预测和优化酶抑制剂的准确性和可靠性，为药物研发和治疗疾病做出更大贡献酶抑制剂的定量构效关系和分子模拟研究在药物研发中发挥着重要的作用。
基于固定化酶的乙酰胆碱酯酶抑制剂体外筛选模型的建立
基 于 固定 化 酶 的 乙酰 胆 碱 酯 酶 抑 制剂 体 外 筛 选 模 型 的建 立
陈 晨 ’ 。 ，史 倩 ， 陈军辉 ， 张茹潭 ，李 鑫 ， 郑 立 ， 王 小如 ’
（ １ ．国家海 洋局第 一海洋研究所现代分析技术及 中药标准化重点 实验 室 ， 青岛 ２ ６ ６ ０ ６ １ ； ２ ．上海海洋大学水产与生命学 院，上海 ２ ０ １ ３ ０ ６ ； ３ ． 厦 门大学化学化工学院 ， 厦门 ３ ６ １ ０ ０ ５ ） 摘要 以可重 复使用 的固定 化酶代替游离态酶 ， 建立一种基 于 比色分析的 乙酰胆碱酯酶 （ Ａ Ｃ ｈ Ｅ ） 抑 制剂体外
Ｖｏ １ ． ３ ４
２ ０ １ ３年 ５月
高 等 学 校 化 学 学 报
ＣＨＥＭＩ Ｃ ＡＬ Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｃ ＨＩ ＮＥＳ Ｅ ＵＮＩ ＶＥＲＳ Ｉ Ｔ Ｉ ＥＳ
Ｎｏ． ５
ｌ ｌ ２ １一ｌ １ ２ ６
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ７ ５ ０ ３ ／ ｃ ｊ ｃ ｕ ２ ０ １ ２ ０ ７ ７ ２
Ａ Ｃ ｈ Ｅ反应器， 结合毛细管 电泳和质谱等检测方法用于 Ａ Ｃ ｈ Ｅ抑制剂体外 的筛选 ＿ １ 埔 Ｊ ．采用 固定化
Ａ Ｃ ｈ Ｅ代 替游 离态 Ａ Ｃ ｈ Ｅ发展 固定 化酶 模 型筛 选 Ａ Ｃ ｈ Ｅ抑 制 剂 的研 究 较 少 ，仅 Ｈｕ等 ｌ 和 Ｌ ｉ ｕ等 分
别采用电喷雾质谱和基质辅助激光解离飞行时间质谱作为检测方法 ， 建立了相关的模 型； 但 质谱仪价 格昂贵 ， 因此该方法难 以普及和推广．在前文＿ ２ 的基础上 ， 本文建立了基于比色法 固定化酶体外筛选
筛选新模 型．采用 以氨基化硅胶为载体 固定 的 Ａ Ｃ ｈ Ｅ优化 了实验条件 ，用 Ａ Ｃ ｈ Ｅ抑 制剂 阳性 对照物他 克林和
酶抑制剂筛选的研究进展
酶抑制剂筛选的研究进展20世纪60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。
酶抑制剂新药发现的途径：一是来源于天然化合物，包括动植物和各种微生物等，二是化学合成物。
在目前上市的药物中，以受体为作用靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。
因此，酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。
以酶为靶点开发新药存在巨大潜力，今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。
1 我国酶抑制剂筛选的进展我国对酶抑制剂的研究起步较晚，始于20世纪70年代末，但是我国进行有计划、有规模的筛选还不到10年，以前的工作没有成规模的化学合成作基础，筛选分散，随机性大。
只有最近一些年来，随着高通量筛选和组合化学及组合生物合成技术的结合，规模化筛选药物得到了极大的发展，国内许多单位相继开展了酶抑制剂的筛选工作，福建省微生物研究所、上海医药工业研究院、中国医学科学院医药生物技术研究所、四川抗生素研究所等对酶抑制剂进行了大量研究。
国内最为显著的是对血脂调节剂HMG-CoA还原酶抑制剂的研究。
高通量筛选技术的发展，是我国筛选酶抑制新药的重大突破，1998年，中国医学科学院药物研究所引进了国内第一台微量闪烁计数器（microplate scintillation & lurminescense counter）对96孔板进行快速的放射性活性测定，使放射免疫实验及放射配基实验自动化、微量化，实现了从整体动物模型向高通量筛选模型的转化，为酶抑制剂的大规模筛选奠定了基础。
目前，国内利用高通量筛选每周可筛选数万个化合物。
2 酶抑制剂源目前，酶抑制剂主要来源于植物、微生物和化学合成。
微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物和次级代谢产物，研究最多的是放线菌，也是产生微生物药物最多的类群，其中最重要的是链霉菌属（streptomyces）；细菌、真菌也是酶抑制剂的重要药源微生物。
SortaseA酶抑制剂的进展
提 要：Sortase A酶是一种介导革兰氏阳性细菌细胞壁与表面蛋白共价结合的蛋白酶。近年来研究表明Sortase
A酶在变形链球菌黏附于牙面的过程中起到关键作用，而口腔变形链球菌是主要致龋菌之一，通过对Sortase A酶的研究
有望开辟新型抗菌药物的筛选途径和新的治疗方法。目前，有关用Sortase A酶作为靶蛋白的研究主要集中在抑制剂的方
1 SrtA酶与变形链菌之一，Igarashi等 首先发现变形链球菌中的SrtA酶并对其编码基因srtA的序列 进行测定。在这项研究中，确定srtA基因存在于变形链球菌 细胞壁中，同时完成了其完整的核苷酸序列测序。结果发 现，变形链球菌的srtA基因由741 bp组成，该基因编码分子 量为27 489，由246个氨基酸组成的转肽酶蛋白，即SrtA酶， 它可以介导细菌表面蛋白的锚定。SrtA酶的三维结构显示其 由8条β-折叠、1条α-螺旋卷曲形成，其中有2条带有3个转 角 的 螺 旋 连 接 到 β -折 叠 上 ， Cys184、 Arg197和 His120为 SrtA酶 活 性 中 心 。 此 后 ， 他 们 发 现 SrtA中 含 有 一 种 CbzLPAT的 氨 基 酸 序 列 ， 其 中 Cbz是 一 种 苄 氧 羰 基 的 保 护 组 ， T部分是一种苏氨酸衍生物，可以替换羰基群-CH2-SH，该 酶通过T部分形成一种双硫键连接于活性位点Cys184的硫醇 基，形成一种共价的SrtAΔN59-LPAT复合物，即苏氨酸介导
第2期
王敬雯，等. Sortase A酶抑制剂的研究进展
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性，但这些天然产物对SrtA酶的抑制机理并不完全清楚。
[7]
Kim等 又在黄花贝母鳞茎的己烷提取物中提纯出一种 β-谷甾醇-3-O-吡喃葡萄糖的化合物，其最低抑菌浓度与去 除了吡喃葡萄糖侧链的提纯物谷甾醇作对照，发现粗提物的 抑制活性优于提纯物，这提示其活性敏感度的提高可能依赖
Rho激酶及其抑制剂的研究进展
Rho 激酶及其抑制剂的研究进展段为钢1,袁胜涛2,廖 红1,严 明1,张陆勇1*(中国药科大学1.新药筛选中心,2.江苏省药效研究与评价服务中心,江苏南京210009)摘要:Rho 激酶是近十年来发现参与细胞运动的主要激酶之一,对细胞的分裂、收缩、粘附、迁移、分泌等活动具有重要调节作用。
Rho 激酶的高表达或过度激活与许多心脑血管疾病的发生发展密切相关,R ho 激酶现在已经成为新药研发的重要靶点,而R ho 激酶抑制剂的不断发现为心血管、神经系统等疾病的治疗提供了新的希望。
为此,本文就Rho 激酶及其抑制剂的研究做一简要综述。
关键词:R ho 激酶;抑制剂;新药筛选中图分类号:R 916 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2007)10-1013-10收稿日期:2007-05-17.基金项目:国家科技部/十五0重大计划资助项目(2004AA2Z3785);江苏省教育厅/江苏省研究生培养创新工程0(02705024);教育部新世纪优秀人才支持计划.*通讯作者 T e:l 86-25-85391036,Fax :86-25-85303260,E-m a i :l drugscreen @126.co mAdvances i n t he study of Rho ki nase and its i nhi bitorsDUAN W e-i gang 1,YUAN Sheng -tao 2,LI A O Hong 1,YAN M ing 1,Z HANG Lu -yong1*(1.N e w D rug Screeni ng Center, 2.J iang su Center for Pharmacodynam ics R esearch and Evaluation ,China Pharmaceutical Uni versity,N anj i ng 210009,China )Abstract :Rho kinase ,a lso na m ed Rho associated kinase ,is one of the i m portant k i n ases found i nrecent ten years ,wh ich regu lates cell m ove m ent i n clud i n g cy tod i e resis ,con traction ,adherence ,m igrati o n,secretion ,etc .The Rho kinase up -regulation in activ ity or i n expressi o n i n vo l v es the prog ress o f card i o -cerebr o -vascu lar disor ders ,and Rho k i n ase has been regarded as a key tar get in drug discovery and deve l o pm ent .W ith m ore and m ore Rho kinase i n h i b itors popping up ,Rho k i n ase i n h i b itors are beco m ing a pr o m i s ing so l u ti o n to car d i o vascu lar d iseases ,neural disorders and other d iseases .The artic le rev ie w s the advances i n the study o f Rho k i n ase pathw ay and its inhibitors ,other i n for m ation associated w ith Rho kinase is a lso discussed .K ey w ords :Rho assoc iated k i n ase ;i n h i b itor ;dr ug screening Rho 激酶(Rho assoc i a ted kinase ,ROCK ),是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶[1]。
酶抑制剂筛选模型研究进展
合， 更 要观 察药 物对 酶 活性 的影 响 。 根 据酶 的特点 ， 酶 的反 应底 物 和产 物 都可 作 为检 测指 标［ ２ １ 。以酶 为 作用 靶 点 的 高
通量 检 测 方 法 ， 绝 大 多数 是 直 接 检测 酶 的活 性 ， 主 要 有 基
酶 的专 ＿ 二 抑制 剂 作 为药 物 ， 来调 节体 内的异 常代 谢 。 酶 抑 制剂 作 为药 物 的治 疗 基 础 是 通 过 限制 酶 催 化底 物 的 反 应 能力 ， 使 底 物 浓 度增 高 或 代 谢 产 物 浓度 降 低 ， 以 达 到 改善 症状 的 目的 。在一 系列 酶 促 反应 中 ， 以抑 制 限速 酶 或 关键 酶 的效 果 最好 。在 目前 上市 的 药物 中 ， 以受 体 为
靶 点 的药 物 占 ５ ２ ％， 以酶 为靶 点 的药 物 占 ２ ２ ％， 以离 子 通 道 为靶 点 的药 物 占 ６ ％， 以核酸 为靶 点 的 药物 占 ３ ％。酶 抑 制 剂 的开 发是 新药 的 重要 来源 。随 着现 代 生物科 学技 术 的
于放 射性 的方法 和基 于 比色 、 荧 光 的方 法 两大 类［ ３ １ 。 曹鸿 鹏 等 采 用荧 光 分 析法 建立 了流 感 病 毒 神经 氨 酸 酶抑 制 剂 的高 通量 筛选 模 型 ， 从 甲型及 乙 型流 感 病 毒 中制 备 出神 经氨 酸酶 ， 以有荧 光 特性 的化合 物为 酶 的底 物 ， 利 用
为分 子水 平 的筛 选模 型 ，也 有 少量 细胞 水 平 的筛 选 模 型 。
筛选 以酶 为 作 用靶 点 的药 物 ，不 仅 要 观 察 酶 与 药 物 的 结
域 。随着 酶学 研究 的深 入 ， 对 酶结 构 的认 识 ， 已能在 分 子水
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酶抑制剂筛选模型研究进展通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。
并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。
标签：酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。
随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。
酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。
在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。
在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。
酶抑制剂的开发是新药的重要来源。
随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。
药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。
在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。
随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。
酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。
动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。
细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。
本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。
1 高通量筛选模型高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。
高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。
酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。
筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。
根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。
以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。
曹鸿鹏等[4]采用荧光分析法建立了流感病毒神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型，从甲型及乙型流感病毒中制备出神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶的底物，利用96孔板建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。
方法：96孔板中，100 μl体系中含有20 μmol/L MUNANA（底物），3 μl神经氨酸酶溶液，10 μl待测样品溶液，37℃，pH 3.5，孵育15 min，355/460 nm测定荧光强度。
张冉等[5]采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。
从小肠上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖为底物，通过测定体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。
方法：384孔微板中，20 μl体系中含有10 μl酶提取液，30 mmol/L的蔗糖5 μL，待测样品5 μl，37℃，孵育30 min，505 nm波长下测定吸光度。
李婷等[6]也建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。
方法：96孔板中，160 μl体系含2.5 mmol/L和0.2 U/ml α-葡萄糖苷酶，37℃，pH 7.0，反应15 min，400 nm波长处测定吸光度。
V ollmer等[7]采用放射法建立了一种以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法。
PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。
方法：96孔板中加入莫诺霉素混悬液，然后加入3H标记的PBP（细菌膜粗提物）和受试化合物，孵育，过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其的影响。
另外，根据酶的特点，还有一些特殊的方法。
肖尚志[8]建立了醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选模型。
组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞至8～15代时，用胰蛋白酶消化后，接种至24孔板，加入胎牛血清浓度为10%、葡萄糖浓度为37.5 mmol/L的培养液，含药血清20 μl，孵育48 h后，收集细胞，离心取上清液，与辅酶NADPH加上足量的底物在一定缓冲体系中反应。
由于NADPH 为自身含有荧光的物质，故反应后，高效液相色谱367/455 nm波长下检测荧光强度便可反映NADPH的消耗情况，从而推算出醛糖还原酶的活性。
Hammonds 等建立了真核生物拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的高通量筛选方法。
啤酒酵母菌株经改造后使表达人拓扑异构酶Ⅱα或Ⅱβ。
将细胞与受试药物在96孔板上孵育后，在630 nm波长处测其吸收度值，从而检测药物对细胞生长情况及酶活性的影响。
高通量筛选模型已成功应用于p56lck激酶、DNA拓扑异构酶、醛糖还原酶、神经氨酸酶、环氧化物水解酶[9]、转谷氨酰胺酶等抑制剂的筛选。
2 固定化酶反应器（IMER）固定化酶是通过物理和化学的方法，将酶固定于特定的载体上制成仍具有催化活性的酶的衍生物。
固定化酶不需要高纯度的酶，降低了对酶的需求，对热、有机溶剂和pH的稳定性增加；可以反复长期使用，只需要简单的清洗过程，就可以恢复活性。
与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、更高的稳定性，并能减少酶的自身降解，因此在酶抑制剂的筛选中得到越来越广泛的应用。
主要缺点是固定化酶对底物的亲和力略有降低，可能是由于：①酶固定化后，活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；②在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用。
IMER以阳性药来评价模型的有效性。
2.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型卢大胜等[10]建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型。
以高脱乙酰度壳聚糖为载体，以三羟甲基磷（THP）为交联剂，将α-葡萄糖苷酶的N端固定，装柱，模拟其在体内小肠壁上的情况。
方法：直径0.5 cm、长5.5 cm的层析柱中，加入50 μl PNPG（0.116 mol/L），待测样品，37℃水浴中反应10 min，用紫外分光光度计在400 nm波长处测定吸收度值。
与游离酶相比较，固定化酶筛选模型上的酶由于N端被固定，其空间结构有所制约，从而使与底物的结合受到一定程度的限制，导致其在实验中的活力偏低，但这正是它模拟酶在小肠壁上的情况，所以实验中反映出来的数据更接近于体内。
该固定化酶筛选模型可重复使用，适合高效、便利、快速的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，还可直接在体外评价α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用效果，研究一些已知能够治疗糖尿病的天然产物的作用机制。
2.2 IMER-HPLC将酶固定到色谱填料上，用装柱的方式制成IMER，与高效液相系统及质谱系统联用，可以进行酶抑制剂混合物的快速筛选。
该法将色谱系统的选择性、快速、无破坏性及重现性与IMER的特异性和灵敏性相结合，可以极大的增强检测的灵敏度，且可用于痕量化合物的检测，因此在药物筛选中具有广阔的前景。
Bartolini等[11]采用IMER-HPLC方法建立了人重组体乙酰胆碱酯酶（hrAChE）抑制剂的筛选模型。
采用戊二醛为交联剂，将hrAChE固定于12 mm×3 mm i.d的CIM整体柱：CIM柱经缓冲溶液平衡后，放入10%的戊二醛缓冲液中暗处搅拌6 h后，加入hrAChE稀释（1.74 U/100 μl）反应过夜。
加入10 ml，0.1 mol/L的氰基硼氢酸溶液，25℃反应2 h后用缓冲溶液冲洗。
将CIM柱装于合适支持物中即可用于高效液相色谱法，紫外检测器450 nm波长处测吸收度。
方法：一定浓度的底物单独进样，其峰面积为A0，含一定浓度底物的抑制剂进样，其峰面积记为Ai，则酶的百分抑制率为100-（Ai/A0×100）。
该模型的建立减少了酶的用量，极大地提高了分析速度，实现了酶抑制剂的快速筛选，以及混合物的筛选。
2.3 IMER-HPLC-MS/MSIMER色谱串联质谱，可以直接获得酶的活性信息、碎片信息、结构信息及亲和信息，实现了酶抑制剂的高通量筛选。
Hodgson等[12]建立了腺苷脱氨酶的IMER色谱串联质谱法。
采用溶胶-凝胶技术将腺苷脱氨酶固定于毛细管整体柱：DGS加水制成凝胶，加入适当pH的腺苷脱氨酶溶液中，迅速加入40 μl多聚腺苷水溶液，充分混合后转入长80 cm，内径250 μm，外径360 μm的聚酰亚胺涂渍的熔融硅管中。
封口，pH 6.5，陈化5 d。
将整体柱切为10 cm长度作为色谱柱用于高效液相串联质谱进行抑制剂筛选。
采用两元泵液相色谱，A泵以底物为流动相，B泵以底物、待筛样品混合物为流动相，总流速保持不变，通过梯度改变两泵的流速比来调整待筛样品的浓度。
通过多反应监测模式在线质谱检测，可分别获得产物、底物浓度，根据产物的减少和底物的增加来评价被筛样品对酶活性的影响，通过定量分析还可获得抑制剂的IC50值、K1值和Km值。
IMER色谱串联，降低了筛选成本，减少了分析时间，无需色谱分离过程，实现了酶抑制剂的快速筛选以及酶抑制剂混合物的筛选[13]。
IMER已成功应用于多巴胺β-羟化酶、α-葡萄糖苷酶、β-分泌酶、腺苷脱氨酶、苯乙醇胺N-甲基转移酶等抑制剂的筛选。
3 动物模型动物模型是以动物为药物筛选的对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。
药物筛选中应用的动物模型通常是动物的病理模型。
理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性[14]。
由于很多因素会影响与酶靶点作用的化合物的药理作用，在体外对靶分子或细胞作用较强的物质，在体内可能会被迅速降解或经过旁路途径功能的调整而降低或消除活性成分的作用，许多在体外作用强度较高的酶抑制剂活性成分在生物体内可能显示不出理想的作用效果，因此必须通过动物模型进行复筛[15]。
醛糖还原酶抑制剂筛选的动物模型主要有四氧嘧啶诱导模型和链脲佐菌素诱导模型[16]。
动物给药后，提取分离血浆中的红细胞，采用分光光度法、柱层析法、荧光法和ELISA等方法测定红细胞中醛糖还原酶的活性。
神经氨酸酶抑制剂筛选通常采用感染了致死性流感病毒的小鼠或雪貂为对象[17]，通过观察不同给药时间药物对致死性、体重减轻及动脉氧饱和度降低的保护作用，评价药物的作用。