天然药物活性筛选中心筛选模型
天然药物化学研究与新药开发
·265·天然药物化学研究与新药开发周小丽 赵 媛 钱慧琴 新乡医学院三全学院 河南新乡 453003摘 要：纵观人类发展历史可知，人类一直都以天然药物来治病防病。
在自然界天然产物就是生物进化中基于自然选择后留下的一种二次代谢物，并且丰富多样、具有类药性。
在临床医学上用到的药物大多直接或间接源自这些天然产物，并且启迪了药物合成、药物化学、药物设计等领域的思路。
在研究开发新药中，天然药物化学发挥着很重要的作用，并且引起了科学家的广泛重视。
当前，天然产物已然发展成为医治严重疾病的先导物质或药物开发的关键性源泉。
基于此，本文探讨了天然药物化学及有关新药开发内容。
关键词：新药开发 天然药物化学 药物研究在自然学科领域，天然药物化学属于一门极其重要的药学基础学科。
其中主要通过先进的科学方法，来深入研究、探讨中药、天然药物内含的化学成分，主要涉及天然产物成分提取、理化性质、结构鉴定等内容。
自加入WTO以来，我国制药行业也迎来了新的发展机遇，中药与天然药物的专业研发也要求及时迈向新的阶层，并以此来赢得国际市场，所以开发新药的工作便显得尤为重要。
1天然药物化学基础研究概述天然药物化学，主要是基于现代科学理论与方法，来深入研究、分析天然药物中所含有的化学成分。
在研究的过程中，往往会针对天然药物，来探究其中的活性或有药效的成分，分析药物结构、物理化学性质、分离提取技术、鉴定方法等。
同时，就主药物的种类与成分，还会研究化学及生物合成方法等。
天然药物防病治病的原理，主要就是药物中含有有药效的成分。
但在同类天然药物中，一般都会存在结构、性质不一样的诸多种化学成分。
在中药中存在的化学成分也是起到药效的基础，深入研究则是中药实现现代化的核心内容。
除了能够揭示中药药物的作用机理、配伍理论、方剂规律外，还有助于药材质量控制、制剂技术优化、中药质量控制标准制定乃至中药的现代化，进而令中药得以走向世界。
譬如，在中药麻黄中，便包含着左旋麻黄碱等之类的诸多种碱类生物物质、挥发油、树脂、淀粉、纤维素、叶绿素、草酸钙等化学成分；在中药甘草（根、根茎）中，便包含着诸如甘草酸、甘草次酸等之类的诸多种三萜皂苷、淀粉、黄酮类、草酸钙、纤维素等化学成分。
药物发现与药物筛选
十二、药物发现和研究基本模式 (Strategy for drug discovery) 以化合物为中心的药物设计 天然及合成的化合物 天然配体的类似物
十二、药物发现和研究基本模式 (Strategy for drug discovery) 以靶点为中心的药物设计 （target-centered drug design） 高通量筛选 组合化学 基于结构的药物设计 先导物的优化
Blood and Bloodforming Organs
24
5
46
已知药物靶点生物学分类
*
01
02
4.药物靶点与新药发现
*
关于药物靶点 概念错误 导致药物研究投入增大。成功率降低 药物靶点；候选靶点；潜在靶点； 功能蛋白 药物靶点 特异性靶点，主导靶点，优势靶点，非特异靶点
药物靶点的定义
七、药物靶点及其研究现状
*
所谓药物靶点，简单的定义就是指那些能够与特定药物特异性结合并产生特定作用（主要是指调节生理功能，改变病理过程，缓解疾病症状，治疗疾病等作用）的生物大分子或特定的生物分子结构。
在上述定义中有两个重要的前提条件，即药物和药物作用。没有药物存在或没有认识药物作用之前，利用上述定义判断药物靶点就不适用了。因此，发现新的药物靶点需要在理论上和实验方面给予全面的研究和认识。这也是当前许多研究人员面对人类基因组研究的成就盲目乐观的主要原因。
思考题：
*
根据药物发现的形式和特点，论述药物发现的基本规律。
01
药物靶点的基本条件有哪些，如何判定新的药物靶点。
02
药物候选化合物的基本条件有哪些，如何区别先导化合物。
03
二、药物发现的基本规律
*
方式
中药现代化研究新思路_天然药物化学与生物学研究相结合
中国天然药物 2008年 1月 第 6卷 第 1期
CJNM
Ch in J N at M ed Jan. 2008 Vol16 No11 3
适合高通量筛选 ,可直接得出分子水平的作用靶点及机 理 ,发现构效关系 ,药物用量少 ;缺点是缺少药物体内代谢 的过程 ,靶点单一 、容易漏筛 。体内筛选模型的特点是能 够准确反映药物对机体的作用及在体内的代谢过程 ;缺点 是个体差异大 、药物用量大 、成本高 、实验周期长 。
建议在研究作用靶点不明确的样品时应尽量选择多 个相关模型进行筛选 ;如条件允许尽量采用体内和体外筛 选模型相结合的方法 ;对提取物和部位而言 ,由于其对分 子靶点模型干扰较大 ,应尽量采用整体动物模型或模式生 物模型进行活性筛选 。
表 1 不同层次筛选模型的特点
模型
体内 /体外
受试样品 用药量
提取物 单体
结果 稳定性
整体动物疾病模型 体内
适合 适合 大 一般
组织 、器官模型
体外
适合 适合 大 中等
细胞 、分子模型
体外 不太适合 适合 小
高
模式生物模型
体内
适合 适合 中 中等
4) 可自动鉴别出有价值的前体药物 (必须通过生物 体内过程才能发挥药效 ) ;
5) 可筛选作用靶点尚不明确的抗菌药物 ; 6) 可筛选通过提高机体免疫发挥抗菌作用的药物 。
《药学概论》学习指南
第一章 绪论模块导学：重点难点指导：重点：药品、药学的定义，药学研究的主要任务。
难点：新药研究与开发的过程。
教学设计：本部分主要以介绍药学相关知识背景为主，结合临床现状以及具体药物研发案例，进一步理解药学的定义、主要任务以及其核心学科之间的联系，系统地掌握本章的重点和难点内容。
第二章 中药与天然药物第一节 中药的起源与发展理解并掌握按照医学理论指导下使用药物的分类，注意掌握在传统医学理论下使用的药物与在中医理论下使用的药物及民族药物的异同点；中药、生药、天然药物的异同点。
第二节 中药学药学的概念：药品、药学的定义。
药学的起源与发展：现代药学起源及发展、我国药学的现状与发展。
药学的任务：研发新药、新制剂、药物作用机理、控制药物质量、规 范药品管理等。
药学的地位：药学在现代科学、国民经济中的地位以及药学二级学科之 间的关联。
绪论注意掌握和理解中药的四气五味、升降沉浮、性味归经、中药的五味与生药实际味道的相关性；中医的五脏与现代医学脏器的相关性及中药的炮制目的；生药与饮片的区别。
第三节 生药学重点掌握生药的三个主要发展时期，生药学的主要研究内容及发展方向；海洋生药学与传统生药学的相关性。
生药学的发展方向及研究内容与任务第四节 天然药物化学着重理解天然药物化学的发展历史及中药化学的相关性；掌握天然药物化学的研究内容、创新药物研究开发的一般途径和方法、创新药物研究的目的和意义。
了解天然药物化学在创新药物研究中的作用和意义、基础课与天然药物化学的关系。
第三章 药物化学1、药物化学的定义药物及药物的使用和制造，是人类历史上最辉煌的一页。
数千年来，只有一个中心目标就是为改善人们的健康，延长人类的寿命而努力。
药物是指对失调的机体某种生理功能或生物化学反应过程呈现有益调节作用的化学物质。
包括对疾病的预防、诊断和治疗。
广义的药物还包括生物制品如疫苗、类毒素和抗毒素等。
药物化学是关于药物的发现、发展和确证，并在分子水平上研究药物作用方式的一门学科。
弹性蛋白酶抑制剂筛选方法的建立及天然产物对其抑制活性观察
弹性蛋白酶抑制剂筛选方法的建立及天然产物对其抑制活性观察陈立平;尹相利;方玉春;郝立杰;赵烽【摘要】发现弹性蛋白酶抑制剂是治疗肺气肿等疾病药物的重要研发方向之一.本研究用弹性蛋白酶建立微量、高效的体外抑制剂筛选模型,利用西维来司钠作为阳性对照,验证了筛选模型的稳定性和灵敏度,并筛选了33种中药单体对弹性蛋白酶的抑制活性,其中部分化合物表现一定的抑制活性.【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》【年(卷),期】2011(024)003【总页数】5页(P209-213)【关键词】弹性蛋白酶;筛选方法;活性筛选【作者】陈立平;尹相利;方玉春;郝立杰;赵烽【作者单位】烟台大学药学院,山东烟台264005;烟台大学药学院,山东烟台264005;海洋药物教育部(中国海洋大学)重点实验室,山东青岛266003;烟台赛尔斯生物技术有限公司,山东烟台264006;烟台大学药学院,山东烟台264005【正文语种】中文【中图分类】R96人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)是一种存在于体内的破坏性酶，它能水解某些结缔组织成分如弹性硬蛋白、蛋白多糖和某些类型的胶原质[1].该酶由于炎症刺激从白细胞中释放，它的过多表达和过高活性参与多种疾病的病理过程[1－4].因此，弹性蛋白酶抑制剂具有潜在的应用价值.另外，由于弹性蛋白酶破坏胶原纤维及组织基底膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以，弹性蛋白酶还是研发抗癌药物的新靶点[5－6].开发弹性蛋白酶抑制剂作为治疗炎症相关疾病药物和抗癌药物已成为目前药物研发的一个新热点，目前国外一些著名制药公司已竞相开展了针对上述疾病治疗药物的研发.例如，日本Fujisawa公司分别从Streptomyces resistomycificus和Flexibacter sp.代谢产物中分离得到人白细胞弹性蛋白酶抑制剂 FR901277[7]和FR901451[8]，前者可阻止由HLE诱导的小鼠足部水肿，后者可防止由HLE诱导的仓鼠肺出血.日本OnoSokki公司2002年4月获得了弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠的生产许可，该药物是全球首个治疗伴有全身性炎症反应综合征的急性肺损伤药物[9－10].能选择性地抑制中性粒细胞释放弹性蛋白酶.张灿等[11]设计并合成了4类13个西维来司钠类似物，但是活性测试结果表明13个样品对弹性蛋白酶的抑制活性均不及西维来司钠.本实验的目的在于构建微量、高效的体外弹性蛋白酶抑制剂筛选模型，进一步从植物提取物、微生物代谢产物库以及化合物库中筛选新的HLE抑制剂，发现活性药物前体[12－13].1 材料与方法1.1 材料1.1.1 中药单体大黄素、木犀草素、橙皮苷、芹菜素、丹皮酚、莽草酸、柚皮苷、白藜芦醇、金丝桃苷、原花青素、黄芩素、穿心莲内酯、细辛醚、川穹嗪、熊果苷、芦丁、葛根素、二氢青蒿素、苦参碱、厚朴酚、齐墩果酸、青蒿素、黄芪甲苷、蛇床子素、氧化苦参碱、阿魏酸、大黄素甲醚、吴茱萸碱、和厚朴酚、甘草酸、汉防己甲素、松萝酸、熊果酸，由烟台赛尔斯生物技术有限公司提供.1.1.2 试剂及仪器西维来司钠(Sivelestat sodium salt hydrate，S7198)、底物(N-methoxysuccinylala-ala-pro-val-p-nitroanilide，M4765)购自Sigma公司，弹性蛋白酶(30 U/mg)为常州千红生化制药股份有限公司产品，对硝基苯胺购自烟台赛尔斯生物技术有限公司.3111型单道可调移液器(德国Eppendorf公司)，XW－80A型旋涡混合器(上海精科实业公司)，5810R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)，全自动酶标仪(美国Biotek集团).1.2 方法1.2.1 体外筛选模型的建立(1)溶液配制.底物用DMSO溶解，配制成10 mmol/L溶液，－80℃保存备用.使用前用10%DMSO(DMSO∶PBS=1∶9)稀释至100 μmol/L.弹性蛋白酶用PBS溶解，配制成10 U/mL溶液，－80℃保存备用，使用前用PBS稀释.西维来司钠用水溶解，－80℃保存备用，使用前用水稀释.(2)标准曲线的测定.弹性蛋白酶可以特异性地水解底物，采用分光光度法测定被分解出的对硝基苯胺(pNA)在405 nm处的吸光度值，计算酶活力以及抑制率.根据以上测定原理，首先精确称取对硝基苯胺(pNA)10.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加1 mL DMSO溶解，用PBS稀释定容至10 mL，作为原液保存备用.取20 μL原液用10%DMSO(DMSO∶PBS=1∶9)稀释至 1 mL，分别取 200、150、100、50、30、20、10、5、1 μL 置于 96孔酶标板中，加10%DMSO至200 μL，对应的浓度分别为:147.7、110.8、73.9、36.9、22.2、19.7、7.39、3.69、0.74μmol/L 以 PBS 为空白对照，设两组平行，在405 nm下测定吸光值，以浓度和吸光值绘制标准曲线.(3)酶浓度筛选.所有反应均在96孔酶标板中完成.每孔分别加入不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 U/mL)的酶液90 μL，DMSO 10 μL，37 ℃保温5min后，加入100 μmol/L 的底物溶液100 μL，反应总体积为200 μL，空白对照孔加入200 μL 10%D MSO，设平行2组，37℃保温反应不同时间点时，测定405 nm吸光值，求平均值.(4)阳性对照药物西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制活性测定.以西维来司钠作为阳性对照药物验证筛选模型的灵敏度和稳定性.每孔加入2.5 U/mL的酶液90 μL，不同浓度(反应终浓度分别为 1000、500、250、125、62.5、31.25 μmol/L)的西维来司钠溶液10 μL，37℃保温5 min后，加入100 μmol/L的底物溶液100 μL，反应总体积为200 μL，同时设100%酶活性对照孔，即用10 μL PB S代替西维来司钠溶液，空白对照孔用等体积10%DMSO代替.37℃保温反应60 min后，测定405 nm吸光值.1.2.2 天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性测定精确称取各天然产物，用DMSO溶解配制成20 mmol/L溶液备用.取已经配好的酶液135 μL、15 μL样品加入1.5 mL离心管中，37℃反应5 min后加入150 μL底物，同时设100%酶活性对照组、空白底物组(即用等体积10%DMSO代替底物)、空白对照组.设置两个平行孔，37℃保温反应60 min后，离心(10000 r/min，5 min)，从每管取上清200 μL于96孔酶标板中，在405 nm波长处读取每孔吸光值.反应总体积为300 μL，药物在反应体系中的终浓度为1 mmol/L.按照以下公式计算药物对弹性蛋白酶的抑制率.抑制率(%)=100×[1－(A药物－A空白底物)/A100%酶孔].2 结果与分析2.1 标准曲线的建立以405 nm吸光值对pNA浓度进行线性回归，得工作曲线方程:Y=0.0028X+0.0472(R2=0.9982，n=9).在 0.74 ～147.7 μmol/L 浓度范围内线性良好(图1)，说明在此范围内pNA的浓度与吸光值成线性.2.2 酶反应曲线特点从不同酶浓度下的酶反应曲线(图2)可知，酶浓度为10 U/mL时，15 min左右即可将底物完全水解，生成对硝基苯胺的吸光值达到最大.酶浓度为0.625和0.3125 U/mL时，酶的活力较弱，120 min仍然不能够将底物完全水解.酶浓度为2.5U/mL时，酶活性中心与底物基团的结合速度与生成物的生成速度一致，60 min 可将底物全部水解，此时间段及相应酶浓度值适宜于模型效应评价及活性筛选.故将酶的用量确定为2.5 U/mL，反应时间确定为60 min.图1 pNA标准曲线Fig.1 Standard curve of pNA图2 酶反应的速度曲线Fig.2 Velocity curve of enzyme reaction2.3 西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制活性西维来司钠对弹性蛋白酶表现出显著的抑制活性，并呈现良好的剂量依赖关系(图3)，西维来司钠的半数抑制浓度(IC50)为43.3 μmol/L.重复3次试验得到的作用曲线基本一致，表明此活性筛选模型具有良好的重现性.图3 西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制曲线Fig.3 Inhibition curve of Sivelestat sodium2.4 部分天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性利用上述的反应条件，筛选了33种常见中药单体成分对弹性蛋白酶的抑制活性，结果见表1.所选取单体化合物包括黄酮、蒽醌、生物碱、萜类等天然产物化学中最主要的结构类型.表1 各中药单体对弹性蛋白酶的抑制活性结果Tab.1 Inhibitory effect of natural compounds on the activity of elastase如表1所示，阳性对照药物西维来司钠在1 mmol/L浓度下可完全抑制弹性蛋白酶的活性.芦丁、熊果酸、金丝桃苷、汉防己甲素对弹性蛋白酶表现出不同程度的抑制活性.这4种活性化合物的分子结构式见图3.3 讨论及结论图4 4种活性化合物的分子结构式Fig.4 Molecudar structure of 4 active chemicals人白细胞弹性蛋白酶是多形核白细胞因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶.作为一种蛋白水解酶，弹性蛋白酶是已知的最有破坏性的酶，它以分解不溶性弹性蛋白为特征，具有广泛的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种光谱的肽链内切酶.弹性蛋白是肺、血管壁和其它器官的重要组成部分，因此弹性蛋白酶被认为参与肺气肿、囊性纤维化、慢性支气管、急性呼吸窘迫综合症、肾小球肾炎、肝炎和类风湿性关节炎等慢性炎症疾病的发病过程.本研究在成功地建立了针对治疗上述疾病的筛选药物方法的基础上，筛选了33种天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性，所选天然产物包括了黄酮、蒽醌、生物碱、萜类等天然产物化学中最主要的结构类型，以初步探讨哪些类型的天然化合物对弹性蛋白酶具有较好的抑制活性，结果表明芦丁、金丝桃苷、汉防己甲素对弹性蛋白酶具有较好的抑制活性，其中芦丁为黄酮类化合物、金丝桃苷为黄酮苷化合物，二者均具有黄酮母核，提示天然黄酮类化合物可能有潜力成为弹性蛋白酶抑制剂.这些结果为进一步从植物提取物、微生物代谢产物库以及化合物库中筛选新的弹性蛋白酶抑制剂，发现活性药物前体提供了一定的参考依据.参考文献:[1]Tremblay G M，Janelle M F，Bourbonnais Y，et al.Anti-inflammatory activity of neutrophil elastase inhibitors[J].Curr Opin Invest Drugs，2003，4(5):556－565.[2]Betsuyaku T，Nishimura M，Takeyabu K，et al.Decline in FEV1 in community-based older volunteers with higherlevels of neutrophil elastase in bronchoalveolar lavage fluid[J].Respiration，2000，67(3):261－267.[3]Doring G.The role of neutrophil elastase in chronic inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med，1994，150(6 Pt 2):114－117.[4]Steinmeyer G J，Kalbhen D A.The inhibitory effects of an-tirheumatic drugs on the activity of human leukocyte elastase and cathepsinG[J].Inflamm Res，1996，45(7):324－329.[5]Sun Z，Yang P.Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression[J].Lancet Oncol，2004，5(3):182－190.[6]Dona M，Dell'Aica I，Pezzato E，et al.Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis [J].Cancer Res，2004，64(17):6225－6232.[7]Keiko F，Yasuhiko S，Hiroshi H，et al.FR901277，a novel inhibitor of human leukocyte elastase from Streptomyces resistomy cifious[J].J Antibiot，1993，46(6):908－912.[8]Takashi F，Hiroshi H，Kenichi H，et al.FR901451，a novel inhibitor of human leukocyte elastase from Flexibacter sp.I.Producing organism，fementation，isolation，physicochemical and bidogical properties [J].J Aantibiot，1994，47(12):1359－1362.[9]杜冠华，吴松，冯文化.西维来司钠治疗急性肺损伤研究现状[J].中国药学杂志，2004，39(5):321－324.[10]徐凌，蔡柏蔷，单渊东，等.弹性蛋白酶抑制剂对严重急性呼吸综合征急性肺损伤有效性和安全性随机开放、平行对照、多中心临床研究[J].中华内科杂志，2005，44(2):147－148.[11]张灿，郭炼伟，高向东，等.西维来司钠类似物的合成及其对弹性蛋白酶的抑制活性[J].中国药物化学杂志，2006，16(3):129－130.[12]郑智慧，任晓，司书毅，等.白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA－2554A的研究[J].中国抗生素杂志，2007，32(5):273－274 [13]魏亚闪，张华，路新华，等.微生物来源的人白细胞弹性蛋白酶[J].河北师范大学学报:自然科学版，2007，31(5):659－660.。
中成药新药的研究方法
中成药新药的研究方法1. 中成药新药的研究方法包括了临床前研究和临床研究两个阶段。
2. 在临床前研究阶段，可以采用分离纯化中药有效成分、药效成分的筛选和鉴定、体内外药效学实验等方法，以确定中药新药的活性成分和药效机制。
3. 还可以运用现代分子生物学、基因组学和蛋白质组学等技术手段，揭示中药在分子水平上的作用机制和靶点，为中成药新药的进一步研究提供依据。
4. 在临床研究阶段，可以采用临床观察、随机对照试验、队列研究等方法，评价中成药新药的安全性、有效性和临床应用价值。
5. 还可以利用药代动力学、药效动力学、药物相互作用研究、药物代谢研究等方法，揭示中成药新药在体内的代谢、药效学特性和作用机制。
6. 对于慢性病的中成药新药研究，还可以采用长期随访、队列研究等方法，评价其长期疗效和安全性。
7. 对于急性病症的中成药新药研究，可以利用加速药代动力学试验、药效学实验等方法，快速评价其治疗效果和安全性。
8. 在中成药新药研究中，还可以采用系统药理学研究、分子影像学研究等方法，揭示中药的多靶点、多途径作用机制。
9. 还可以利用现代生物技术手段，如基因编辑技术、表观遗传学研究等，改良中药活性成分，并进行药效学验证。
10. 对于疾病模型的中成药新药研究，可以采用细胞模型、动物模型等方法，评估其治疗效果和作用机制。
11. 在中成药新药研究中，应重点关注药物的安全性评价，包括急性毒性、慢性毒性、致癌性、致畸性等评价方法。
12. 对于中成药新药的药物质量标准研究，可以采用指纹图谱分析、化学成分分析、质量控制方法学等方法，确保药物的质量稳定性和一致性。
13. 在中成药新药的研究中，还需要考虑到药物的制剂工艺研究，包括中药提取工艺、纯化工艺、制剂工艺等。
14. 在中成药新药的研究中，应充分考虑中华药理学、中医药学基础理论的指导，结合现代药物研究方法，探索中成药新药的研究路径。
15. 对于跨学科研究方法，在中成药新药的研究中还需要考虑到中西医结合的研究方法，结合中医药疗法和西药治疗手段，寻找更有效的新药治疗方案。
近五年国内外天然药物化学发展方向
近五年国内外天然药物化学发展方向近五年国内外天然药物化学发展方向【摘要】:随着中药现在化与国际化的发展趋势，天然药物化学在中药现代化进程中发挥着前所未有的重要作用其重要性越来越引起人们的重视。
目前我国天然药物化学依其目的不同分为3个方面：以阐明天然动物、植物、矿物、海洋天然产物等有效成分，获得具有新结构的化合物或具有生物活性的单体为目的，进行提取分离条件、结构鉴定、一般活性研究；以解决自然资源有限的活性化合物或其前体的来源为目的，进行半合成、全合成及生物转化研究；以获得高效低毒的创新药为目的，以天然活性化合物为先导，合成一系列类似物进行构效关系研究，由此创制具有自主知识产权的新药。
天然药物研究已经从最初对天然来源活性化合物被动全盘接受到积极主动地改进，研究水平不断提高创新能力大大增加。
【关键词】：天然药物化学活性研究合成新药天然药物化学是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门科学。
天然药物化学在中药现代化进程中发挥着十分重要的作用，并成为医药院校中许多专业的必修课程。
中药材在天然药化开始是从中药材开始的，中药经历了几千年的传承，其疗效是长期临床中医学实践证明的。
然而，由于中药的复杂性，其治病机理一直模糊不清，以至于影响了中药当今的发展。
中药现代化，多年来一直是药学人士苦苦追求的目标，也是中药及其制剂以药品的名义走出国门，进入国际医药市场的关键。
21世纪将是天然药物化学有史以来发展最快的时期，其主要任务包括：（1）用现代科学技术方法对传统药物进行再评价，使经验实验化、定性和定量化，质量标准制定的化学和生物活性“指纹”化。
（2）生药基源动物、植物、矿物和近源物种化学成分的研究，并探讨其生物活性（包括有效性和毒性）的差异，开发新的药用资源，走可持续性利用之路。
（3）以经验和生物活性为线索，寻找创新药物研究的候选化合物。
（4）以天然化合物为工具，探讨生物活性作用靶点，发展新的天然药物筛选模型。
药学专业综合、开放性实验的开发与实践
药学专业综合、开放性实验的开发与实践摘要】我们对药学专业本科生综合性、开放性实验教学进行了探索，结合学校针对学生项目的开展和资助，从项目申报、实验的组织与开展、实验教学的管理与评估等几个方面构建了药学综合、开放性实验体系。
结果表明：这种实验教学模式，加了学生思维能力和创新精神的培养，有效地提高了学生的综合素质。
【关键词】药学专业综合性实验开放性实验实践教学引言国外高等药学教育发展趋势显示,在其本国药学发展状况下,药学教育往往以培养职业型、实践型、应用型人才为主[1]。
随着社会发展和经济全球化进程的加快，我国医药产业面临的国际竞争日益激烈，高等药学教育的教育观念应逐渐转变,培养药学生的"综合创新者"意识和"药学服务者"意识，以适应当前国内外形势下药学领域对药学人才的需求，适应未来人才竞争[2]。
近年药学院校迅速增多，生存需求及趋同心理使各药学院校一时间失去明辩医药领域人才需求形势的能力、盲目跟风。
老的药学院校将注意力集中于科研课题、硕博培养、重点学科的竞争和比较方面，新的药学院校则在专业设置、学制、课程设置等方面亦步亦趋,力争扩大影响。
但因为办学水平有差距，新的药学院培养出的学生考上研究生比例很小，实际动手能力很差，处于两难境地，与市场需求有较大差距，在就业市场上缺少竞争优势。
因此有必要探索适合于二类学院药学本科生实践教学的模式和方法。
1 药学专业综合、开放性实验的开发我校的药学专业属于大药学方向，实验室包括药理、天然药化、药物化学和药物合成、药物分析、药剂等普通实验室。
其中的设备都是为教学准备的，仅凭这些实验设备要进行综合、开放性实验，引起不了学生的兴趣。
为了充分利用实验室的现有资源，增加学科间的融合，我们将药学与基础医学充分结合。
随着教师申报的科研项目增多，我们把综合、开放性实验项目与老师的科研课题结合起来，充分利用教授们的实验条件。
这样，一方面使学生尽快接触到本专业的最前沿领域，培养科学研究能力，增强学习兴趣。
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天然药物活性筛选中心筛选模型抗肿瘤（抗炎）药物活性筛选体外肿瘤细胞毒筛选模型活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成蓝紫色产物，颜色与活细胞数目以及细胞活力成正比。
该方法是细胞活性检测的经典方法，广泛应用于检测细胞增殖和抑制、化合物或者精制组分的体外肿瘤细胞毒性、化合物对受试细胞的半数生长抑制浓度IC50值的确定、化合物对受试细胞的抑制效应与剂量相关性以及化合物对肿瘤细胞与非肿瘤细胞的选择性毒性测定等。
该模型可用于评价化合物对体外肿瘤细胞生长及增殖的抑制活性，也可用来指导精制组分中的抗肿瘤活性单体的追踪分离，检测结果准确，重复性好，可高通量进行。
体内抗肿瘤药效评价模型（裸鼠移植瘤）采用移植人肿瘤的免疫缺陷小鼠为模型，对于体外筛选中获得的具有抗肿瘤活性的药物进行体内活性评价。
该模型广泛应用于抗肿瘤药物研发，是抗肿瘤药物研发中的重要环节，结果综合反映药物的体内作用效果，为评价化合物的成药性提供重要的数据。
一氧化氮（NO）生成抑制剂筛选一氧化氮（nitric oxide, NO）具有广泛而重要生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。
当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶（induced NO synthase，iNOS），生成NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。
NO的含量测定间接反映iNOS的表达水平或酶活性水平，而编码iNOS的基因是NF-κB信号通路的直接靶基因，因此该检测结果也是评价化合物激活NF-κB信号通路活性的重要指标。
NF-κB信号通路与肿瘤及其他疾病发生密切相关，因此该模型检测结果对化合物抗肿瘤、心血管以及神经系统等的活性具有重要的提示作用。
该模型直接评价化合物抑制NO生成的活性，适合通量筛选，快速，灵敏。
可通过预刺激确证化合物是否作用于NF-κB信号通路，为进一步作用机制的研究提供线索。
NF-κB信号通路抑制剂筛选核转录因子NF-κB通过调控多种基因的表达，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生与转移等多种生理过程。
细胞中的NF-κB与抑制性蛋白I κBα结合形成复合物，并被滞留于细胞质而处于非活化状态，当细胞受到各种胞内外刺激时，IκBα被迅速地降解，NF-κB得以释放并进入细胞核，调控与细胞周期和凋亡密切相关的系列靶基因的表达。
在多种肿瘤的发生发展中均发现NF-κB信号通路的异常激活，因此该信号通路的抑制剂具有重要的抗肿瘤药物成药前景。
该模型应用双荧光素酶报告基因系统直接检测化合物对NF-κB信号通路的抑制作用，方法直接、灵敏，检测结果是化合物是否作用于信号通路的直接判断依据。
wnt信号通路抑制剂筛选wnt/β-catenin信号通路通过调控细胞周期，增殖和分化密切相关的基因（如cyclin D1, C-Myc等）表达，在早期胚胎发育，成体细胞增殖以及干细胞的自我更新过程中行驶着重要的调控功能，该信号通路的异常激活与肿瘤的发生发展直接相关，是重要的抗肿瘤药物潜在靶点。
规模化筛选抑制wnt信号通路的小分子化合物是目前国内外肿瘤药物研发领域的热点，wnt信号通路抑制剂具有重要的抗肿瘤药物成药前景。
该模型应用双荧光素酶报告基因系统直接检测化合物对wnt/β-catenin 信号通路的抑制作用，检测快速，灵敏度高，可高通量进行。
蛋白酶体抑制剂筛选模型蛋白酶体是一种高度保守的多价催化蛋白酶复合物，广泛存在于真核细胞的核内和细胞质内。
这种复合物能催化水解连接有多聚泛素链的蛋白，是泛素-蛋白酶体通路的主要组分，作为体内蛋白质降解的途径之一，控制着细胞的分化、生长、凋亡等过程具有非常重要的生理作用，与肿瘤发生发展密切相关，抑制蛋白酶体的功能是肿瘤治疗的重要靶点，目前已发现通过抑制蛋白酶体对肿瘤有明显疗效的药物，如硼替佐米已批准用于治疗耐药的多发性骨髓瘤患。
该模型针对蛋白酶体复合物的核心20S催化颗粒进行筛选，可直接评价化合物对蛋白酶体的抑制活性，检测靶点明确，快速，灵敏度高。
IκB激酶-β(IKK-β)抑制剂筛选模型NF-κB信号转导途径与炎症和肿瘤的发生、发展密切相关。
IκB激酶(IKK)是该信号通路转导过程中的重要蛋白。
当细胞受到胞外信号刺激时，IκBα激酶(IKK)被激活，使IκBαN端丝氨酸残基发生磷酸化，并在蛋白酶体的作用下被识别并降解。
从IκBα释放出来的NF-κB迅速从胞浆转移到细胞核，激活相应靶基因表达，从而调控炎症肿瘤等疾病的发生发展。
IKK-β抑制剂的研究对于抗炎抗肿瘤新药的开发具有重要意义，是抗炎抗肿瘤药物的重要潜在靶点。
该模型直接检测化合物对IKK-β激酶的抑制作用，应用荧光比色的方法，检测靶点明确，快速，灵敏度高。
微管蛋白聚合解聚筛选模型微管是细胞骨架以及细胞分裂所需细胞器仿垂体的重要组成成分，处于聚合和解聚的高度动态平衡状态。
在肿瘤细胞有丝分裂期，微管参与了染色体的定位、移动以及分离至两个子细胞中，干扰微管的聚合和解聚，能够有效阻断细胞分裂和增殖，因此是肿瘤治疗的重要靶点。
目前临床使用的抗肿瘤药物长春花碱，秋水仙素以及紫杉醇类药物均通过该靶点发挥重要的抗肿瘤作用，因此针对微管筛选新的抗肿瘤药物具有重要的意义。
该模型通过荧光比色直接针对微管蛋白的聚合和解聚过程进行检测，检测靶点明确，方法快速，灵敏度高。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂筛选模型组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)通过对染色体进行结构修饰在调控基因表达过程中发挥着重要作用。
在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶共同调控。
HDAC使组蛋白去乙酰化，导致基因转录受到抑制，在多种肿瘤细胞中均发现HDAC的异常激活从而抑制了抑癌基因的表达。
因此组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类重要的靶向抗肿瘤药物。
该模型通过荧光比色直接检测化合物抑制HDAC的活性，检测靶点明确，方法快速，灵敏度高。
神经系统药物活性筛选乙酰/丁酰胆碱酯酶（AChE/ BuChE）抑制活性筛选模型乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh)是一种重要的神经递质。
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE ) 是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶(Butrylcholinesterase, BuChE ) 是胆碱酯酶存在于体内的另一种同工酶形式，是水解丁酰胆碱的特异性胆碱酯酶。
老年痴呆症（Alzheimer’s disease, AD）等神经退行性疾病患者脑内乙酰胆碱水平低下，寻找高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂是开发治疗神经退行性疾病药物的基础。
该模型以他克林（胆碱酯酶抑制剂）作为阳性对照，化合物与乙酰/丁酰胆碱酯酶的混合液在30℃反应，乙酰/丁酰胆碱酯酶能够催化其底物类似物碘化硫代乙酰/丁酰胆碱降解，生成硫代胆碱和乙酸/丁酸，反应生成物与显色剂DTNB 反应生成黄色物质，在405nm处有特异光吸收。
如果化合物对乙酰/丁酰胆碱酯酶有抑制作用，那么乙酰/丁酰胆碱酯酶催化底物类似物碘化硫代乙酰/丁酰胆碱降解的量就会减少，相应的与DTNB反应生成的黄色化合物减少，即在405nm 处的光吸收值变小，以此来筛选具有抑制活性的化合物。
促进PC12细胞分化活性筛选模型神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是最早发现的能够促进神经细胞存活、生长和分化的神经营养因子，已经开发应用于外周感觉性神经病、早老性痴呆等神经系统疾病的临床试验。
然而，NGF的某些蛋白质性质（如化学性质不稳定、半衰期短、药代动力学特性欠佳、不易通过血脑屏障等）限制了其成为理想的临床用药。
因此，寻找小分子NGF类似物成为神经系统药物开发的热点。
该模型以未分化的PC12细胞为实验对象，采用包被培养方式，以NGF为阳性对照，化合物溶媒作为对照组，诱导72h后，显微镜下观察并记录PC12细胞分化情况，统计分析细胞分化率（轴索长度≥细胞直径的细胞百分数）、具有轴索的细胞数、细胞平均轴索数、梭形细胞比例等细胞分化的形态学参数，以此筛选出具有促进PC12细胞分化活性的化合物。
钙流活性筛选模型钙（Ca）是人体内重要的必需元素之一，生物体内几乎所有的生理活动都受钙离子（Ca2+）调控。
钙离子作为第二信使把外源信号转变成胞内信号，导致一系列胞内事件及生理反应的发生，如基因表达、细胞凋亡、肌肉收缩等。
研究表明Ca2+的信使功能是通过调控细胞内Ca2+浓度来实现的。
该模型以细胞为检测对象，使用离子指示剂Fluo 4-AM作为细胞内Ca2+的测定技术。
Fluo 4-AM是Fluo 4的一种乙酰甲酯衍生物（AM），通过培养，能够轻易进入细胞中。
AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生Fluo 4，未结合的Fluo 4荧光很弱，与游离的钙离子(Ca2+)结合后产生强烈荧光。
使用Thermo Scientific 高内涵药物筛选仪，激发光485nm，5s检测一次，持续检测5min，以荧光的变化来判定细胞内钙离子浓度的变化，从而评价化合物的钙流活性，为下一步的作用机制研究提供线索。
线虫长寿模型I即线虫daf-16转位入核药物筛选。
daf-16位于Insulin-like生长因子（IGF）信号通路下游，该信号通路调节线虫的发育、生长、体长、繁殖及繁殖率、代谢以及行为等。
作为神经内分泌信号通路之一，该通路也调节线虫压力的耐受性。
以这个信号通路为靶标的化合物可能对线虫抗衰老甚至抗神经退行性疾病会有显著作用。
该模型以TJ356线虫株为实验对象，TJ356是daf-16::GFP转基因线虫株，正常情况下，daf-16分布在胞质，当化合物作用于Insulin-like生长因子（IGF）信号通路时，daf-16转入核内调控一系列基因的表达，在荧光显微镜下可见核内聚集荧光，由此可以确定化合物是否对于该信号通路有作用。
线虫长寿模型II即线虫寿命（Lifespan）药物筛选。
衰老指在正常状况下生物发育成熟后，随年龄增加，自身机能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退行性变化，趋向死亡的不可逆转的现象。
衰老是一种渐变的、泛化的、全身性的功能衰退，从而导致生物体对环境的耐受性降低和疾病以及死亡的发生。
生物体的这种衰老是可以通过改变生物体之间保守的信号通路、基因或者通过给药得到延缓，并且衰老的延迟往往推迟了相关疾病的发生。
寻找抗衰老活性的化合物是延缓衰老甚至延迟相关疾病发生的基础。
该模型以N2线虫株为实验对象，通过固体培养方式，采用FUDR平板表面给药的方式，以不作任何处理的FUDR平板作为对照，挑入L4后期N2株线虫，20℃培养，统计两种平板培养方法下N2株线虫的寿命，能延长N2株线虫寿命的化合物，可能具有抗衰老活性。