抗真菌药物筛选模型
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目录
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点 1.2抗真菌药物类型 1.3抗真菌药物作用机制
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法 2.2定靶的筛选方法
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点
顽固性 广泛性 新生性 严重性
1.2抗真菌药物类型
2.2.1真菌细胞壁合成抑制剂筛选
大多数真菌细胞壁成分包括：几丁质，-β葡 聚糖，α-葡聚糖和各种甘露聚糖蛋白。
2.2.1.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂
β-1,3葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分，但 并不出现在人类和其他哺乳动物细胞。因 此β-1,3葡聚糖的合成被期望成为筛选特异 性抗真菌抗生素的理想靶位。
普纳米星（pradimicin）类和贝娜诺霉素（benanomicin） 类在存在Ca2＋的条件下，其有力羧基与细胞表面甘露聚糖 蛋白质复合物的多糖部分络合，导致细胞壁结构异常而破 裂，细胞膜通透性增加，胞内钾外漏而致细胞死亡。
2.2.1.3 几丁质合成酶抑制剂
几丁质是β-(1,4)糖苷键连接的N-乙酰胺基葡 萄糖(GlcNAc)的链状聚合物，是细胞壁的支 架结构。几丁质合成酶催化GlcNAc在细胞膜 上聚合成几丁质，在真菌细胞的分裂和成 熟中起了重要作用。
几丁质合成酶抑制剂筛选模型
筛选方法类似于甘露聚糖合成酶抑制剂方法。
尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是两类几 丁质合成酶抑制剂，因其结构与几丁质的前提尿苷二磷酸 N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）类似而竞争性抑制几丁 质合成酶。
2.2.2 真菌细胞膜合成抑制剂
取原液和稀释液两个浓度的孢子悬液，用血球计数仪计数， 结果分别为3.6×106个/ml、3×106个/ml、5.0×106个/ml.
筛选抗真菌活性
① 取无菌平板加底层沙氏培养基20ml，凝固。取制得的单 孢子悬液，将合适的菌液加入48oC保温的100ml沙氏培养 基中轻轻摇匀。再取5ml注入底层培养基上，摇匀制成含 菌平板。待平板凝固后，取4支无菌钢杯按等距离排放， 一个加入酮康唑对照品，另3个加入受试样品，于28oC培 养3d，观察抑菌圈。
文献报道应用这种方法筛选出许多β-1,3葡聚糖合成酶抑制 剂化合物如arborcandins A~F等。
2.2.1.2 甘露聚糖合成酶抑制剂
甘露聚糖是真菌细胞壁组成中三种多糖之 一，对细胞壁的功能起到十分重要的作用。
甘露聚糖合成酶抑制剂筛选模型
分离啤酒酵母的甘露聚糖合成酶，以[14C]GDP-甘露聚糖为 底物。反应混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、 20mmol/L二甲基砷酸盐缓冲液（pH6.5）、10mmol/L MnCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、待测样品和甘露聚糖合成酶， 25oC反应30min，使用纸层析测定多聚物。
2.12 纸片法
与管碟法类似，用无菌过滤纸片沾取药物 贴在真菌培养基上，观察菌落情况。
传统方法固然存在许多缺点，但由于操作 简单和处理量大，非常适合微生物发酵样 品初筛。
2.2定靶的筛选方法
目前发现作用于真菌的靶位有三种途径：
① 真菌结构成分及代谢产物分析； ② 真菌产物的生物合成途径及其相关酶分子的研究； ③ 控制真菌生长和细胞分裂的基因序列分析。
化学合成的抗真菌抗生素
如：咪唑类，三唑类
微生物来源的抗真菌真菌药物作用机制
① 作用于真菌细胞膜中醇合成的抗真菌药 物
② 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物 ③ 作用于核酸合成的抗真菌药物
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法
选择毒性小的代表性真菌作为试验菌， 采用管碟法或者纸片法测定样品对试验的 抑制或杀伤活性。
检测菌孢子制备
取冻干管中菌接种到沙氏斜面，28oC培养；白色念珠菌培 养24h，表皮癣菌96h，新型隐球菌48h；
然后分别传代，培养至子三代；取孢子长势良好的子斜面 1支加入灭菌生理盐水5ml，用接种环刮下孢子，转移至盛 有玻璃珠的三角瓶。
同样方法处理3次，孢子液合并于三角瓶，轻轻震荡30min， 然后过滤得孢子悬液。
② 取灭菌的300ul沙氏液体培养基，以每孔50ul的量加入到 96孔细胞培养板的个孔中；取50ul样品溶液分别加入到96 孔板的第1行个孔中（从第2列开始留1列作空白对照）， 每1列从第1行开始依次倍半稀释到最后一孔（即第8行）， 然后在 28oC培养16～18h，在倒置显微镜下观察孢子生长 的菌丝形态，判断其活性，计算最小活性浓度。
2.1.1 管碟法
以白色 念珠菌为指示菌，对微生物进行筛 选。
检测菌的培养基：
1. 马铃薯培养基：蔗糖1.5％，马铃薯2.0％，琼脂2.0%,pH 自然；
2. 沙氏培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5％，葡萄糖4.0％， 琼脂2.0％，pH自然。
发酵样品处理主要用超声处理，过滤得上 清液，经过无菌过滤。
日本Ohayama建立的筛选模型
提取白色念珠菌和烟曲霉的β-1,3葡聚糖作为反应酶，酶反 应混合物（100ul含）含有 75mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、 0.75mmol/L EDTA、0.75％BSA、1mmol/L UDP-葡萄糖和 0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖（519mCi/mmol）。在酶反应 混合物中加入5ul酶溶液，在30oC培养60min，加入100ml冰 冷的20％三氯乙酸溶液终止反应。滤纸过滤获得沉淀物， 先后使用10％的三氯乙酸和95％的乙醇洗涤、风干，加入 100ml的液闪试剂，使用液闪仪测定放射活性。计算酶活 性，筛选时在酶反应混合物中加入测定样品。
真菌细胞膜是一种渗透屏障，可作为小分 子和信号传导的通路。
细胞膜由磷脂类、鞘脂类和固醇类物质组 成，为各种功能蛋白提供基本的骨架。
2.2.2.1麦角固醇生物合成抑制剂
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组分， 在真菌生活中其重要作用。
一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦 角甾醇生物合成途径中不同环节的酶，干 扰真菌麦角甾醇生物合成，发挥抗真菌作 用。
抗菌药物筛选的实验方法与技术
抗菌药物筛选的实验方法与技术博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)摘要为了筛选出活性更好的抗菌药物，本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
结果显示，样品1（环丙沙星）对二者有杀菌作用，最小抗菌浓度都为1.56 μmol·L-1。
样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用，最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。
样品17、19、20、24、26、28，表现出对大肠杆菌较好的抑制作用，其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)，IC50值为1.72 μmol·L-1。
样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性，IC50值分别为11.04 μmol·L-1和24.44 μmol·L-1。
关键词抗菌药物筛选体外实验微量稀释法1 引言一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实。
一般采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。
药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。
因此，体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。
体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。
但是，体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。
本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作，以熟悉细菌培养的过程，并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。
2实验部分2.1药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO以44种化合物(见表1)。
新型抗菌药物的筛选与评价
新型抗菌药物的筛选与评价在当今的医学领域，抗菌药物的研发至关重要。
随着细菌耐药性的不断增强，寻找新型、高效、低毒的抗菌药物已成为当务之急。
新型抗菌药物的筛选与评价是一个复杂而系统的过程，涉及多个学科和技术的综合应用。
首先，我们来谈谈新型抗菌药物筛选的源头——化合物库的建立。
化合物库可以来源于天然产物、化学合成以及微生物发酵产物等。
天然产物是一个巨大的宝库，其中包括植物、动物和微生物中提取的各种化学成分。
许多传统的抗菌药物，如青霉素，就是从天然产物中发现的。
化学合成则能够根据特定的靶点设计和合成具有潜在抗菌活性的化合物。
微生物发酵产物也为我们提供了丰富的资源，一些特殊的微生物在其代谢过程中会产生具有抗菌作用的物质。
筛选模型的建立是新型抗菌药物筛选的关键环节。
常见的筛选模型有体外抗菌活性测试、细胞模型和动物模型等。
体外抗菌活性测试是最基础的筛选方法，通过将待筛选的化合物与细菌在培养皿中共同培养，观察细菌的生长情况来判断化合物的抗菌效果。
细胞模型则更接近体内环境，利用细胞培养技术，观察化合物对感染细胞的保护作用。
动物模型是最接近临床实际的筛选方法，但成本较高、操作复杂。
例如，可以用小鼠建立细菌感染模型，然后给予待筛选的药物，观察动物的生存情况、感染部位的病理变化等指标来评价药物的疗效。
在筛选过程中，高通量筛选技术的应用大大提高了筛选效率。
这种技术能够同时对大量的化合物进行快速检测，快速筛选出具有潜在抗菌活性的化合物。
但高通量筛选也存在一定的局限性，比如可能会出现假阳性或假阴性结果，因此需要进一步的验证实验。
筛选出具有潜在抗菌活性的化合物后，接下来就是对其进行深入的评价。
药物的安全性评价是首要任务。
需要评估化合物对正常细胞的毒性，以及是否会引起过敏反应、致畸作用等。
通过细胞毒性实验、动物急性毒性实验等方法，可以初步了解药物的安全性。
药物的药代动力学特性也是评价的重要内容。
这包括药物的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
棋盘法和倍比微量稀释法在体外联合抗真菌活性药物筛选中的应用研究
棋盘法和倍比微量稀释法在体外联合抗真菌活性药物筛选中的应用研究尹光美;苏刘艳;李俊;李加秀;胡金玲;张祎;王睿睿【摘要】通过对氟康唑和盐酸小檗碱体外联合抗白色念珠菌活性检测,比较棋盘法和倍比微量稀释法在体外联合抗真菌药物筛选研究中的应用,优选更适合实验室体外联合抗真菌药物通量筛选的方法.分别用2种药物筛选方法检测氟康唑和盐酸小檗碱联合对白色念珠菌的活性,计算抑菌联合指数,其抑菌联合指数(FICI) ＜0.5,则表明两药具有协同作用.棋盘法和倍比微量稀释法均能验证氟康唑和盐酸小檗碱联用具有协同作用,但倍比微量稀释法操作更简单,抑菌联合指数的计算更直观,更适用于大批量药物的筛选.倍比微量稀释法更适合于实验室体外联合抗真菌药物的通量筛选.【期刊名称】《云南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(028)003【总页数】5页(P246-250)【关键词】棋盘法;倍比微量稀释法;抗真菌;联合用药;药物筛选【作者】尹光美;苏刘艳;李俊;李加秀;胡金玲;张祎;王睿睿【作者单位】云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500;云南中医药大学中药学院,云南昆明650500【正文语种】中文【中图分类】R914近年来，广谱抗菌药物、免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及器官移植、导管插管等技术的普遍应用，导致临床上真菌感染病例不断增多.其中以白色念珠菌为主的致病性真菌感染较为常见，在条件致病真菌感染中位居第2[1-3]，随着临床上抗真菌药物氟康唑长期大量使用导致白色念珠菌耐药性普遍产生，临床治疗越发困难[4-6].目前，耐药性是临床治疗真菌感染失败的主要原因[7-8].由于新药研发的投入高、周期长、进展缓慢[9-10]，联合用药可以发挥药物的协同抗真菌作用，提高疗效，并减少真菌耐药性的产生[11]，因此寻找与现有抗真菌药物联合应用效果较好的药物也是行之有效的方法之一[12].体外抗真菌药物敏感性实验是指导制定合理的临床诊疗方案重要的参考依据[13].对于大批量联合抗真菌药物的筛选来说，建立快速通量筛选药物的方法非常必要.棋盘法是最为常用的联合用药筛选方法，但操作较为复杂，其MIC值的判定常规用肉眼观察，在一定程度上受主观因素影响较大，缺乏客观性和准确性；倍比微量稀释法常用于单药抗菌活性筛选，实验数据的处理具有客观性，如在单药基础上改为两药联合，操作比棋盘法简单，但其数据信息量较棋盘法少.根据权华等[16]的研究，氟康唑与盐酸小檗碱联合使用具有协同抗耐药白色念珠菌的作用，故本文分别采用2种方法检测氟康唑和盐酸小檗碱对耐药白色念珠菌的抗菌活性，计算FICI值对比分析后选出操作更加为简便、准确、可行的方法作为实验室大批量联合抗真菌药物筛选的首选方法.1 主要实验药品及仪器氟康唑(南昌弘益药业有限公司，50 mg，171128)；盐酸小檗碱(成都锦华药业有限责任公司，0.1 g，180401)；沙氏液体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，250 g，1069251)；DMSO 溶剂(MP Biomedicals，LLC，100 mL，Q6949)；念珠菌临床耐药株 23#(由昆明医科大学第一附属医院李玉叶教授赠送)按常规方法复苏，划板培养，于4 ℃下保存.酶标仪(M200 PRO 多功能酶标仪).2 实验方法2.1 药液配制氟康唑和盐酸小檗碱均用DMSO溶解，氟康唑配制成50 mg/mL的药物储备液，小檗碱配制成100 mg/mL的药物储备液，4 ℃下保存.2.2 棋盘法2.2.1 操作步骤参照CLSI M27-A(酵母菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感实验)方案[17]，将药物储备液用沙氏液体培养基稀释为2倍倍比质量浓度(药物终质量浓度范围为氟康唑0.25～128 μg/mL，盐酸小檗碱1～64 μg/mL).按照如下方法进行操作：由高浓度到低浓度的顺序，取50 μL倍比稀释的氟康唑，依次加96孔板的第2～11列；由低浓度到高浓度的顺序，取50 μL 倍比稀释的盐酸小檗碱药液，依次加入96孔板的第 B～H 行.除A12孔之外，向其他各孔加入100 μL菌悬液，并加沙氏培养液于少于200 μL 液体的孔.其中，H1孔为生长对照孔，A12孔为空白对照孔.实验重复3次，调节菌浓度为1×105 CFU/mL，37 ℃恒温恒湿培养24 h，以OD值测定法判读结果.上述各药物孔中溶剂DMSO 终浓度均不超过1%，可忽略其对菌体的影响.实验重复3次.2.2.2 OD值测定法用酶标仪读取各孔在波长 625 nm 处的OD值[18].真菌生长抑制百分数的计算方法为：真菌生长抑制百分数=1-(各孔中的OD值-空白对照孔中的OD值)/(生长对照孔中的OD值-空白对照孔中的OD值)×100%.MIC80值的判定 MIC80=10^(log(A)+(a-80)/(a-b)×log(1/N))，其中A为真菌生长抑制百分数大于80%对应上述梯度浓度中的最小浓度，a为A对应的真菌生长抑菌百分数，b为仅小于a的真菌生长抑制百分数，N为稀释倍数.2.2.3 2种药物联合作用效果评价方法本实验采用 FICI法对结果进行评价.该法是以 Loewe additivity(LA)理论为基础发展出的非参数法模型.其公式为FICI=MICA/A+MICB/B (FICI：部分抑菌联合指数). 式中A和B分别为两药单用时的MIC值，MICA和MICB为两药联合时的MIC 值. 当MIC值高于检测最高限时以做高限浓度的两倍值用以计算FICI.本实验中MIC80值的计算以氟康唑的最小真菌生长80%时的抑制百分数来计算.FICI法则是最为常用的解释抗真菌药物相互作用的模型，但不同文献对于FICI值的解读尚存在多种标准，我们在本文中采用“FICI≤0.5为协同作用,0.5<FICI≤4为无相互作用,FICI>4为拮抗作用的标准对实验结果进行判定[14-15,19-20].2.3 倍比微量稀释法2.3.1 操作步骤将氟康唑和盐酸小檗碱储备液用沙氏液体培养基分别稀释至终质量浓度为128μg/mL和64 μg/mL，取无菌96孔板，第1排不加沙氏液体培养基，其余每排中加入100 μL的沙氏液体培养基，于A行加入256 μg/mL的氟康唑药液和128 μg/mL的盐酸小檗碱药液，各3个重复孔，每孔125 μL；联合用药组每孔加入512 μg/mL的氟康唑和256 μg/mL的盐酸小檗碱药液各62.5 μL，终体积125 μL，各3个重复孔；A行每孔吸取25 μL加到B行中，混匀后吸取25 μL到C行中，以此类推到F行，混匀后弃掉25 μL，在A-F行间形成5倍倍比稀释.最后每孔加入100 μL的菌悬液，使菌液浓度为1×105 CFU/mL.另设只加菌液和培养液为阳性对照和只加沙氏培养液为阴性对照，各3个重复孔.上述各药物孔中溶剂DMSO 终浓度均不超过1%，可忽略其对菌体的影响.37 ℃恒温恒湿培养24 h，以OD值测定法判读结果.实验重复3次.其MIC80计算同上述棋盘法.2.3.2 2种药物联合作用效果评价方法同上述棋盘法.3 实验结果3.1 棋盘法实验结果棋盘法实验结果表明：氟康唑和盐酸小檗碱对白色念珠菌耐药株23# 单独运用时，其MIC80大于药物的最大浓度，联合运用时，降低了氟康唑和盐酸小檗碱的MIC80，菌株对氟康唑的敏感性增强，由耐药(MIC80≥128)变得敏感，联用后氟康唑的MIC80在0.5到1之间，同时盐酸小檗碱的MIC80降到了25 μg/mL以下(表1).以MIC80值为基础两药联合后其FICI值均小于0.5，两药之间为协同作用.表1 氟康唑和盐酸小檗碱对白色念珠菌的MIC80和FICI MIC80(μg/mL)单独MIC80(μg/mL)联合氟康唑盐酸小檗碱氟康唑盐酸小檗碱FICI相互作用>128>640.5717.420.14协同作用>128>640.8223.180.18协同作用>128>640.9514.940.12协同作用3.2 倍比微量稀释法实验结果倍比微量稀释法实验结果表明：氟康唑和盐酸小檗碱对白色念珠菌耐药株23# 单独用药时，氟康唑和小檗碱的MIC80均大于药物的最大浓度，两药联合之后，菌株对氟康唑的敏感性增强，联合后氟康唑和盐酸小檗碱的MIC80均降低(表2). 以MIC80为基础，药物的FICI值小于0.5，两药之间为协同作用.表2 氟康唑和盐酸小檗碱对白色念珠菌的MIC50和FICI MIC80(μg/mL)单独MIC80(μg/mL)联合氟康唑盐酸小檗碱氟康唑盐酸小檗碱FICI相互作用>128>6416.538.270.13协同作用>128>6415.517.750.12协同作用>128>6413.896.950.11协同作用注：2种方法实验结果一致，与文献报道相吻合.4 讨论棋盘法和倍比微量稀释法均是根据真菌在不同药物浓度配比中生长程度不同，来获得MIC80，并计算FICI值，从而判断两药之间的相互作用.棋盘法是目前国际上测定并评价药物体外联合作用效果时使用最广泛、最公认的方法，浓度组合多，能精确测定2种抗菌药物在在适当浓度的比例下的相互作用，数据较多，信息较全，更适合全面评价两药之间的相互作用，较为适用于未知MIC值两药联合用药的筛选，但其MIC值判定多用肉眼观察法，受主观因素影响较大，且不能定量地记录结果，使实验结果缺乏一定的准确性和客观性.故本实验中以酶标仪测定OD值的方法对结果进行判读，通过透光率来反映真菌的生长情况，具有客观、定量、迅速简便、重复性好的优点，使实验结果更准确[21].倍比微量稀释法操作简单，浓度组合少，虽然数据量较小，但可减少工作量.我们实验中用棋盘法和倍比微量稀释法检测氟康唑和盐酸小檗碱联合应用对白色念珠菌耐药株23# 的活性，2种方法均能验证氟康唑和盐酸小檗碱联合应用具有协同作用，与文献报道相吻合，说明2种方法均能作为抗真菌药物联合应用的筛选方法.我们发现对棋盘法所得实验结果进行MIC80的计算时，真菌生长抑制百分数的选择会受到主观因素的影响，存在多重标准，如图1 中3组圈内数据均可分别用来计算两药的MIC80值，不同的真菌生长抑制百分数对应的MIC80值结果差距很大，其FICI值(部分抑菌联合指数)也会有很大的不同，存在多重标准，使得实验结果可重复性较差.同时棋盘法中每个浓度组合只有一个孔，操作误差也会影响实验结果的判定.而倍比微量稀释法中MIC80的计算只有一种标准(见图2中圈内数据)，其FICI值的结果也就更具有客观性和准确性；且倍比微量稀释法中每个质量浓度配合有3个孔，可减小操作误差.本实验中规定以氟康唑的真菌生长抑制百分数大于80%所对应的最小浓度来计算其MIC80值.综上所述，棋盘法和倍比微量稀释法均能用于抗真菌药物联合应用的筛选，但2个方法相比较，倍比微量稀释法具有以下优点：①操作简单，节省时间；②在选择MIC80计算FICI值时只有一种标准，实验结果更为客观；③每个浓度组合有3个重复孔，可有效减小误差.故我们认为倍比微量稀释法更适合用于与已知抗真菌药物联合应用药物的快速通量筛选.参考文献:【相关文献】[1] 姜路路. 重楼皂苷Ⅶ抑制白色念珠菌生物被膜形成的作用机制[D]. 大连: 辽宁师范大学, 2018.[2] 方甜甜，宋沧桑，李兴德，等. 阿司匹林与两性霉素B对白色念珠菌生物膜的体外联合作用研究[J]. 中国药物评价, 2014,31(04): 202-204.[3] 谷鹏飞，石宇奇，刘洋. 中药抗白色念珠菌作用的研究进展[J]. 世界最新医学信息文摘, 2016,16(42): 29.[4] 陈作忠，刘萍，马慧萍. 联合用药抗真菌感染的现状与分析[J]. 抗感染药学, 2013, 10(03): 166-169.[5] 汪承英，马超瑜，尹笋君，等. 三种生物碱与氟康唑体外协同抗白色念珠菌活性研究[J]. 解放军药学学报, 2015,31(04): 310-312.[6] 马晓丽. 氟康唑和黄芩苷联合对耐氟康唑的白念珠菌ABC转运蛋白的影响[D]. 昆明: 昆明医科大学, 2013.[7] 石红茁. 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抗真菌活性实验方案
十三种样品抗真菌活性测定1实验仪器及试剂仪器：ZHJH-C1112C型垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）、全自动不锈钢立式电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司）、LRH-250A-G型生化培养箱（广东省医疗器械厂）、FA1004型上皿电子天平（上海天平仪器厂）、96孔板、试管、移液枪（0-200 μL）、接种针、酒精灯等。
试剂：酮康唑（纯度为99.7％，Sigma公司）、甲醇（分析纯，天津科密欧化学试剂公司）、葡萄糖、琼脂、KH2PO4、MgSO4、柠檬酸、VB1。
2实验材料供试菌种：小麦赤霉病菌（Gibberelle zeae）、番茄灰霉疫病菌（Botrytis cinerea）、烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）和白色念珠菌（Candida albicans），以上菌株均为本实验室保存菌种。
供试化合物：…………………………………………改良CPDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1.5 g，柠檬酸0.1 g，VB1 10 mg，蒸馏水1000 mL，pH 6.5（固体培养基加20 g琼脂），121 ℃灭菌20 min。
3实验方法3.1菌种的活化配制CPDA培养基，分装于试管中，每管约5 mL，121 ℃灭菌30 min，取出倾斜放置，自然冷却凝固成斜面。
然后，于无菌条件下用接种针于保藏菌种斜面挑取菌丝体用直线法将菌种接种于晾好的斜面上，于培养箱中28 ℃活化72 h备用。
3.2 菌悬液的制备取活化好的供试菌，接于200mL液体培养基中，于28 ℃、150 rpm摇床培养72 h至菌液浓度均匀，再将浓度均匀的菌悬液与45 ℃固体培养基以1：50的体积比混合均匀，得到供试菌悬液。
3.3 对照药品溶液及样品溶液的制备（1）阳性对照药品为酮康唑，用甲醇将其溶解，配制成1 mg/mL的储备液。
采用2倍稀释法稀释样品，得到一系列浓度对照溶液（250 μg/ mL、125 μg/ mL、62.50 μg/ mL、31.25 μg/ mL、15.62 μg/ mL、7.81 μg/ mL、3.91 μg/ mL）。
抗真菌药物发现:过程和结果
抗真菌药物发现：过程和结果帅新嘉【摘要】最新的数据表明几种真菌疾病的全球发病率被低估.其中,侵袭性真菌感染引起的死亡率很高,接近或超过耐药结核病与疟疾的死亡率.显然,新的抗真菌药物、疫苗和诊断工具的基础研究是非常需要的.本文重点阐述抗真菌药物的发现策略,包括体外检测、化合物库和药物靶点鉴定的方法.鉴于基因组挖掘使得鉴定真菌特异性靶标成为可能;然而靶向这些位点的新化合物可能并不在现有抗菌管线中.因此利用专利过期的化合物进行“老药新用”可能是一个更直接的起点.此外物发现需要与结构生物学、同源建模和虚拟成像等技术整合以推动药物发现.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】5页(P369-373)【关键词】抗真菌药;复合库;发现;药物靶点;老药新用【作者】帅新嘉【作者单位】西南大学药学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】R978.51 真菌病的全球发病率超过预期最新的数据表明每年全球有＞100万人死于HIV/AIDS，由这些病原体引起的死亡率与耐药结核分枝杆菌相当，甚至已经超过疟疾。
在侵袭性真菌感染中，如由血液传播的念珠菌病和侵袭性曲霉菌病大多数都避开了实验室的鉴定，而导致了干预治疗的延误。
由HIV/AIDS患者中出现隐球菌性脑炎的病例可知，即使有良好的诊断测试条件，该病仍然非常普遍。
真菌病会对人类健康造成危害，但是我们对真菌病的监测水平却低得令人无法接受。
而侵袭性真菌感染仅代表了真菌疾病的一部分，皮肤癣菌病、阴道念珠病、过敏症和霉菌病等的发病率也远远超过非侵袭性真菌感染，并且至今这些疾病的发病率仍是未知的。
2 耐药性与治疗失败相关病人分离株(白色念珠菌、热带念珠菌、副杆菌病)的最低抑菌浓度与念珠菌病患者的治疗结果直接相关。
分离株分为氟康唑敏感的、易受剂量影响的或耐药的几类。
如果该分离株是耐药的，那么使用氟康唑或伏立康唑治疗成功的几率就会大大降低。
YH-1菌株作为筛选抗真菌模型菌株的初步研究
１ 材 料与 方法
１ １ 供 试 靶 标 菌 株 及 盐 湖 土 样 稻 瘟 霉 （ ｙｉ ｌｒ ． Ｐ ｒ ｕａｉ ｃ ａ
２ ％的 接种 量 转接 到 装 有 ｌＯ Ｌ高 氏 Ｉ 液体 培 养基 Ｏｍ 号
ｏ ｚｅｗＴ） 由河北 师 范大 学 王立 安 教 授 提供 ； 湖 土 样 ｒ ａ， ｙ ， 盐 来 自山西 运城盐 湖 中部 风干土样 ， 由山西运 城学 院崔 东亚
老师提供 。
的 ２０ ５ ｍＬ三 角 瓶 中 ， ８ ℃ 摇 床 培 养 ７ 。将 发 酵 液 于 ２ ｄ ５ ０ ｒｍｉ，离心 １ｍｉ 然 后双 层 滤纸 抽滤 ２次 ， 菌过 ０ ０／ ｎ ０ ｎ， 细 滤 器过滤 １次 ，℃保存 ， ４ 待用 。发酵液 活性 的 检测按 参考
１２ 土样微生物分离 ．
发 建立 了稻 瘟 霉 （ ｙｉ ｌｒ ｒ ａ ） 性 筛 选模 型 ， 成 Ｐ ｒｕａｉ ｏｙ ｅ 活 ｃ ａ ｚ 并 功筛 选 出了多个抗肿 瘤 、 真菌 活 性化 合 物 ， 中 Ｒ ｉ ｘ 抗 其 ｈｚ ． ｏ ｉ、 ｈｚｘｎ Ｆ ｓｒ ｌ ｎ Ｒ ｉ ｉ 、ｕａｉ ｉ Ａ和 Ａ ｓｍｉ ｃ ｏ ｅｎ ｎａ ｔ ｉ Ｐ一３几 种化 合 物 ｏｎ 已被成功地 开发成抗 肿瘤 、 真菌 新药 。 。本 实 验利 用 抗 这一 原理 ， 山西 运城盐 湖 中部 土样 中分离筛 选 出 了多 株 从
关键 词 ： 性 物 质 ； 菌 形 变 ； 活 真 筛选 模 型 中 图分 类 号 Ｑ ３．ｌ ９ ９ １ 文 献标 识 码 Ａ 文章编号 １０ ７ ３ （０ １ ０ —３ ０ ０７— ７ １ ２ １ ） ３ ５— ２
近 年来 ， 以微管 系统 为 靶 点筛 选 新 的抗 肿瘤 、 真 菌 抗 活性物 质的研究方 法 已引起许 多学者 的广泛 关注 … ， 别 特 是 在初筛 阶段 ， 建立 高效 、 快捷 、 敏 、 关 性好 的活性 筛 灵 相
抗真菌活性粘细菌的筛选及鉴定
抗真菌活性粘细菌的筛选及鉴定刘建玲;李宏铎;王军;万一【摘要】[目的]筛选出具有杭真菌活性的粘细菌并对其进行种类鉴定.[方法]从全国23个省、自治区的200个腐殖质土样中分离纯化出237株粘细菌;将菌株在4种不同培养基中发酵培养,发酵产物通过甲醇提取得到代谢产物;以白色念珠菌为模型对次级代谢产物进行高通量筛选.[结果]复筛后得到1株编号为ZJ2的粘细菌,其次级代谢产物具有抗白色念珠菌的活性,对该菌株进行16SrDNA克隆并测序,结果表明ZJ2为橙色粘球菌(Mixoroccus fulvus).[结论]菌株ZJ2的次级代谢产物中,存在对白色念珠菌生长有显著抑制作用的生物活性物质,具有潜在的研究和药用价值.%[ Objective] The paper was to screen myxobaterias with antifungal activity, and identifv its species. [ Method ] 237 myxobacterias were isolated and purified from 200 humus soil samples collected from 23 provinces in China. The strains were fermented in four different media, and the fermentation products were extracted by methanol to obtain metabolites. With Candida albicans as the model, the secondary metabolites were carried out high-throughput screening. [ Result] A strain of myxobacteria numbered Z J2 was ohtaincd after secondary screening, its secondary metabolites had activities against Candida albicans. 16SrDNA cloning and sequencing results showed that ZJ2 was Myxococcus fulvus. [ Conclusion ] The secondary metabolites of ZJ2 strain had bioactive substances with significant inhibition effect against the growth of C. albicans, which had potential study and medicinal value.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)019【总页数】3页(P11485-11487)【关键词】粘细菌;代谢产物;抗真菌活性;高通量筛选【作者】刘建玲;李宏铎;王军;万一【作者单位】西北大学生命科学学院,陕西,西安,710069;西北大学生命科学学院,陕西,西安,710069;陕西省微生物研究所,陕西,西安,710043;陕西省微生物研究所,陕西,西安,710043【正文语种】中文【中图分类】S43粘细菌(myxobacteria)是一类革兰氏阴性菌，多数为(0.6～1.2)μm×(2～10)μm 的细长杆状单细胞，能以粘性分泌液结合成薄而扩散的菌团状，而且能在固体表面滑动并产生子实体和抗逆性强的粘孢子［1-2］。
抗真菌实验
抗真菌实验
实验室里弥漫着消毒水的味道，一群穿着白大褂的科研人员正忙碌着，他们的目光都聚焦在一张张培养皿上。
这是正在进行抗真菌实验的一天。
实验室内，张博士正站在显微镜前，仔细观察着培养皿中的真菌。
他旁边的小王同学紧张地看着，不时地提问：“张博士，这个真菌是哪种类型？”
“这是曲霉菌，一种常见的室内真菌。
”张博士回答道，一边调整着显微镜的焦距。
就在这时，实验室的门被推开了，李教授走了进来，他看到张博士和小王，微笑着说：“你们正在研究哪种抗真菌药物？”
“我们正在进行抗真菌药物的筛选实验，教授。
”张博士回答道。
李教授走到培养皿前，拿起一个镊子，夹起一个菌落，仔细观察了一会儿，然后说：“这个菌落长得有点奇怪，是不是实验条件出了问题？”
“教授，我们怀疑是培养基配比出了问题。
”小王小心翼翼地说。
“那你们赶快重新配制培养基，我建议你们用一种新的抗真菌药物进行试验。
”李教授说完，转身离开了实验室。
小王和张博士立刻行动起来，重新配制培养基，更换抗真菌药物。
经过一番努力，他们终于找到了合适的培养基和药物。
几天后，实验结果出来了，他们发现这种新的抗真菌药物对曲霉菌具有很好的抑制作用。
张博士兴奋地告诉李教授：“教授，我们找
到了一种有效的抗真菌药物！”
李教授微笑着说：“很好，这说明你们在实验过程中发现了问题，并积极去解决。
科研就是要敢于面对问题，敢于挑战。
”
张博士和小王相视一笑，他们知道，这只是他们科研生涯中的一个起点。
在未来的日子里，他们将继续努力，为人类健康事业贡献自己的力量。
秀丽隐杆线虫作为抗感染药物筛选模型的研究进展
近年来 ， 线 虫 模 型 的发 展 推 进 了我 们 对 于 一些 感 染 类 疾
病 发病 机制的理解 ， 而对疾病本质 的深刻认识 自然会 为感染 类 疾病的治疗提供启示 ， 同时也 大大加速 了新 型抗 生素 的发
现。Ｅ ｗ ｂ ａ ｎ ｋ等 综述 了一些种族 抗菌 肽和蛋 白质 ， 可作 为 候选新型抗生素 。并且 阐述 了线 虫感染 系统提供 新 型抗 生 素大规模体 内筛选 的可能性 。这些 发现 为新型抗 菌疗 法提 供 了广阔前景 。 ２ ． ３ 利用秀 丽隐杆线 虫感染模 型研 究新型抗茵药物作 用机 制 减 弱 细 菌 的毒 力 是 抗 菌药 物 的 研 发 的一 个 靶 点 ， Ｈ ｏ
菌 ， 革兰 阴性菌铜绿假单胞菌
、 沙 门菌 ¨ 等。
耐药铜绿假 单 胞菌 （ ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ） 是 常 见 的 院内感染致病菌 。通过 制备耐药 铜绿假 单胞菌 感染 秀丽 隐
秀丽隐杆线 虫可以通过检测并且识别 Ｔ ｏ ｘ Ａ介导的翻译抑制
染。
杆线虫平板 ， 周雨朦等 建立 线虫 一耐 药铜绿 假单 胞菌感
染模 型 ， 并且在感染线虫救治实验中发现 ， 可 以排 除毒性 高 、
体 内外相关性差 的化合物 ， 线虫感染 模型适合用于筛选抑制
耐药菌生长和繁殖 的化合物 。陈丽红 等 建立 了铜绿假单 胞菌 一 线 虫感染模 型 ， 确 立 了最佳 操作参 数 ， 并且研 究 了不 同抗 生素对线虫存 活时间的影 响 ， 得 出了线虫感染程度 可量
２ ． ２ 利用秀丽隐杆线虫感染模型研究细菌致病机制和 线虫
免疫机 制 早 期研究 中， Ｇ ａ ￣ｉ ｎ等 采 用线虫 作为 宿 主模
抗菌和抗真菌试验方法
抗菌和抗真菌试验方法1.引言1.1 概述概述部分的内容：抗菌和抗真菌试验方法是一种用于评估物质对细菌和真菌的抗菌活性或抗真菌活性的实验方法。
在过去的几十年中，随着抗菌和抗真菌药物的广泛使用，抗药性的增加成为了一个全球性的问题。
因此，寻找具有抗菌和抗真菌活性的新物质变得至关重要。
这篇文章将重点介绍抗菌和抗真菌试验方法的选择适当的菌株和实验步骤以及操作要点。
在抗菌试验部分，我们将讨论如何选择适当的细菌菌株，同时介绍实验步骤和操作要点。
同样，在抗真菌试验部分，我们将讨论如何选择适当的真菌菌株，并介绍实验步骤和操作要点。
通过本文的阅读，读者将能够了解到抗菌和抗真菌试验方法的基本原理和步骤，并能够根据不同的实验需求选择适当的菌株和方法。
这将有助于进一步研究和开发具有抗菌和抗真菌活性的新物质，从而为解决抗药性问题做出贡献。
接下来将会在文章结构部分介绍本文的结构和目的。
1.2 文章结构文章结构部分内容：文章结构部分旨在介绍本文的组织结构和各部分的内容。
本文分为引言、正文和结论三个部分。
下面将对每个部分的内容进行详细说明。
引言部分主要包括概述、文章结构和目的三个方面。
首先，我们将概述本文的主题，即抗菌和抗真菌试验方法。
然后，简要介绍文章的结构，即引言、正文和结论三个部分。
最后，明确本文的目的，即为了提供对抗菌和抗真菌试验方法的详细描述和分析。
正文部分主要包括抗菌试验方法和抗真菌试验方法两个子部分。
在抗菌试验方法部分，我们将介绍选择适当的细菌菌株的准则，并详细描述实验步骤和操作要点。
同样，在抗真菌试验方法部分，我们将介绍选择适当的真菌菌株的准则，并详细描述实验步骤和操作要点。
通过这两个子部分的介绍，读者将能够全面了解抗菌和抗真菌试验的具体操作过程。
结论部分主要包括抗菌试验结果总结和抗真菌试验结果总结两个子部分。
在抗菌试验结果总结部分，我们将对抗菌试验的结果进行概括和分析，总结实验中观察到的现象和得出的结论。
同样，在抗真菌试验结果总结部分，我们将对抗真菌试验的结果进行概括和分析，总结实验中观察到的现象和得出的结论。