细胞内细胞因子的流式检测讲解
细胞因子的检测法
细胞因子的检测法细胞因子是一类在细胞间相互作用并调节免疫和炎症等生物学过程的蛋白质分子。
它们在疾病的发生和发展中发挥着关键的作用。
为了研究这些生物分子，科学家们使用多种方法进行细胞因子的检测。
以下是一些常见的细胞因子检测方法：1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：- ELISA是一种广泛用于检测蛋白质的方法。
对于细胞因子，ELISA通常分为直接和间接两种类型。
ELISA的基本原理是通过酶标记的抗体与待测细胞因子结合，然后用底物显色，并通过光密度测定来定量检测目标物质的含量。
2. 多参数流式细胞术：-这是一种同时测量多个生物标志物的方法。
通过将样品与多种荧光标记的抗体混合，然后在流式细胞仪中进行检测，可以在单个细胞水平上评估多个细胞因子的表达水平。
这是一种高通量的方法，适用于复杂的细胞混合物。
3. 生物传感器技术：-生物传感器是一种直接监测生物分子的技术。
对于细胞因子检测，可以使用基于电化学、光学或质谱学的生物传感器。
这些传感器通常具有高灵敏度和选择性，可以用于实时监测。
4. PCR技术：-聚合酶链反应（PCR）可以用于检测细胞因子的mRNA水平。
通过提取RNA并进行反转录，然后使用PCR扩增目标基因的cDNA，可以定量测量细胞因子的mRNA水平。
5. 蛋白质芯片：-蛋白质芯片是一种高通量的技术，可以同时检测多个蛋白质。
对于细胞因子的检测，可以使用蛋白质芯片，其中芯片上包含有多个针对不同细胞因子的抗体点阵。
6. 质谱法：-质谱法可以用于细胞因子的定量分析。
质谱法可以提供非常精准的分子质量信息，对于检测细胞因子的各种变体和修饰具有优势。
选择适当的方法取决于研究的具体需求、实验条件以及实验室的技术和设备水平。
在进行实验前，最好参考相关文献和专业手册，以确保所选方法的可靠性和适用性。
流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验⽅法流式细胞仪实验⽅法⼀、实验准备1．标本制备：2.最⼩化⾮特异性结合：⼆、凋亡1．凋亡的检测⽅法：⽹站和其它2．PI染⾊法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因⼦1．激活的细胞因⼦2．CBA四、⾎⼩板1．活化2．活化检测3．⽹织⾎⼩板五、红细胞1．⽹织红细胞2．PNH3．胎⼉红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋⽩3．多药耐药4．微⼩残留⽩⾎病第⼀部分标本处理⼀、流式细胞术常规检测时的样品制备(⼀)直接免疫荧光标记法取⼀定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每⼀管中分别加⼊50µl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加⼊连接有荧光素的抗体进⾏免疫标记反应(如做双标或多标染⾊，可把⼏种标记有不同荧光素的抗体同时加⼊)，。
孵育20-60分钟后，⽤PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加⼊缓冲液重悬，上机检测。
本⽅法操作简便，结果准确，易于分析，适⽤于同⼀细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较⾼，但减少了间接标记法中较强的⾮特异荧光的⼲扰，因此更适⽤于临床标本的检测。
(⼆)间接免疫荧光标记法取⼀定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加⼊特异的第⼀抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加⼊荧光标记的第⼆抗体，⽣成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本⽅法费⽤较低，⼆抗应⽤⼴泛，多⽤于科研标本的检测。
但由于⼆抗⼀般为多克隆抗体，特异性较差，⾮特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加⼊阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适⽤测定细胞数较少的标本。
⼆、最⼩化⾮特异性结合的⽅法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过⾼，背景会因为⾮特异性的相互作⽤的增加⽽增加。
2．在使⽤第⼀抗体之前，将样品与过量的蛋⽩⼀起培育，如⼩⽜⾎清蛋⽩（BSA），脱脂⼲奶酪，或来⾃于同⼀寄主的正常⾎清来作为标记的第⼆抗体。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞因子 化学发光法 流式细胞法
细胞因子化学发光法流式细胞法
细胞因子的免疫学测定方法包括ELISA法、流式细胞仪法和酶联免疫斑点试验法等。
以下是这三种方法的介绍：
- ELISA法：具有特异、简便、易于标准化等优点，可同时检测大量标本。
其缺点是敏感性偏低，不能判断细胞因子的生物学活性。
- 流式细胞仪法：主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。
- 酶联免疫斑点试验法：便于观察和计数分泌细胞因子的细胞，一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关。
在选择细胞因子测定方法时，需要根据实验目的和条件进行选择。
如果需要同时检测大量样本，ELISA法可能更为合适；如果需要精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况，流式细胞仪法可能更为适合。
流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
细胞因子的流式检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
TH1与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
细胞因子12项流式
细胞因子12项流式
在细胞因子12项流式中，通常会检测多种细胞因子的表达水平，这些细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等。
通过分析这些细胞因子的表达水平，可以更全面地了解免疫系统的
活性和炎症状态。
这种流式细胞术的操作流程通常包括细胞样本的准备、标记不
同抗原的抗体、使用流式细胞仪进行检测和数据分析等步骤。
通过
这些步骤，可以获得关于细胞因子表达的定量和质量信息。
细胞因子12项流式在临床和科研领域都有广泛的应用。
在临床上，它可以帮助医生评估患者的免疫功能状态，辅助诊断炎症性疾
病和免疫性疾病。
在科研领域，它可以用于研究免疫系统在不同疾
病状态下的变化，寻找新的治疗靶点和药物。
总的来说，细胞因子12项流式是一种重要的实验技术，可以帮
助我们深入了解免疫系统的功能和疾病机制，为临床诊断和治疗提
供重要参考。
流式检测细胞因子实验步骤
流式检测细胞因子实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲流式检测细胞因子实验步骤哈！这可是个挺有意思的事儿呢。
首先呢，你得把要检测的细胞给准备好呀。
这就好比要做饭得先有食材一样，细胞就是咱这实验的“主角”呢。
得让它们乖乖地待在那儿，等着咱来摆弄。
然后呢，就是给细胞加上各种试剂啦。
这就像给菜加调料一样，得恰到好处，不然味道可就不对啦。
不同的试剂有不同的作用，可不能加错咯。
接着，就是让细胞和试剂好好地反应反应。
这时候可不能着急，得给它们足够的时间，就像炖肉得小火慢炖才能入味儿一样。
之后呢，把处理好的细胞放到流式细胞仪里去。
嘿，这流式细胞仪就像是个神奇的“眼睛”，能看出细胞的各种小秘密呢。
在这过程中，可得仔细操作呀，就像走钢丝一样，得小心翼翼的。
一个不小心，可能数据就不准确啦。
等仪器检测完了，就到了分析数据的时候啦。
这可需要你有一双“火眼金睛”，能从那些密密麻麻的数据里看出门道来。
你想想看，这细胞因子就像是细胞之间的“悄悄话”，咱通过这个实验就是要去偷听它们在说啥呢。
这多有趣呀！做这个实验，就像是搭积木一样，一步一步都得稳稳当当的。
要是有一步没弄好，那可能整个“大楼”就塌啦。
所以呀，做流式检测细胞因子实验可不能马虎，得认真对待每一个步骤。
只有这样，才能得到准确可靠的结果呢。
这可不是闹着玩的哟！咱得为科学负责，为自己的实验负责呀！你说是不是这个理儿呢？反正我觉得是这么回事儿！好啦，就说到这儿吧，希望你做实验的时候顺顺利利的哟！。
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刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
注意事项
选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过
程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。 ②激活对照 ： 激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否，如果未达到
CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不
操作步骤
细胞表面抗原染色
刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA）
固定、破膜
细胞因子染色
注意事项
标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会
限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8
小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在 8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
细胞内细胞因子的流式检测
基本概念
细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子
抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，
即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-a
Th2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10
技术优势
快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需68小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根 据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分 析 安全：减少样本处理与生物源性污染 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映
了体内状况
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂
如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等 3、溶血素：裂解红细胞 4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚 集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力。