曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的超声提取研究

合集下载

红豆杉体外培养生产紫杉醇技术介绍

紫杉醇分离与提纯
• 有机溶剂-超声波提取法高效液相色谱gt;提取时间>料液比最优方案：原料95℃烘干至恒重，粉碎100目， 95%甲醇，60℃提取20h，料液比1:10 得率：0.086mg/g
Reference
• 内生真菌：生活在健康植物体内，但不引起任何病害性状的真菌。
• 菌种分离：从外植体上长出的菌丝中，挑取不同菌落的菌丝尖端接种到PDA培养基中培养，多次纯化后可得纯株。 • 目前已分离的内生真菌种类不同，产物多样，包括紫杉醇，紫杉酚，芳香族氨基酸脱羧酶等。其中紫杉醇产率 0.024～185.4ug/L，发酵产量很低。生物改造的真菌紫杉醇产率也仅有448.52ug/L，远未达到工业化水平。
红豆杉
• 红豆杉科红豆杉属，全世界共 11种。
• 西藏红豆杉，东北红豆杉，云南红豆杉等。 • 二级濒危植物
紫杉醇（Taxol）
1个卵巢癌患者=6棵树龄60～100年的红豆杉 200kg/年紫杉醇 =1000000棵红豆杉
紫杉醇（Taxol）生产
• • • • • 1从红豆杉非树皮部位提取 2大量种植筛选的优良品种 3化学合成：半合成，全合成 4寻找紫杉醇类似物：Taxotere 5生物技术：细胞培养，基因工程，微生物生产
与传统的整株材料相比,植物细胞悬浮体系具有分散性好、细胞形状及细胞团大小大致相同,而且生长迅速、重复性好、易于控制等优点。
红豆杉细胞悬浮培养
• Bestoso F等欧洲榛的茎，树叶和胚作为外植体
• 第一步培养： MS培养基+3.0mg/LNAA+0.5mg/L激动素 +100mg/L精氨酸+2.5%蔗糖+0.8%琼脂培养2个月，对胚形成愈伤组织的诱导率可86.4%，枝条的诱导率100% 。一段时间后转移到B5培养基上后，可加快愈伤组织的生长。

紫杉醇的研究

首选方法。
2.直接从红豆杉科植物中分离提取
自紫杉醇药效发现以来，红豆杉资源遭到毁灭性开发，有些种系濒临灭绝。
因此，利用人工种植的红豆杉代替野生红豆杉成为必
然．这要求人工栽培的红豆杉品种紫杉醇含量高、生长迅速．因此，人工种植该品种生产紫杉醇的成本很高。
3、直接从紫杉醇产生菌中提取
紫杉醇产生菌主要是一些红豆杉的内生真菌．真菌中
also indicating that YW23 better utilizes glycerol.
specific taxadiene titer are plotted
For each strain, the specific taxadiene titers did not vary significantly between 12°C and 27°C, with a slight decrease observed at 32°C.
Slightly increased expression of certain genes in the MEP pathway by
YW23 does not result in improved taxadiene production.
Normally, this situation might indicate a potential bottleneck in precursor supply
The relationship between p value and differential expression.
348 of the 4070 MG1655 genes were differentially expressed (log 2 (YW22/YW23)>±2) at a statistically significant level (p value<0.01). Of these 348 genes, 243 were upregulated in YW22 while 105 were upregulated in YW23.

紫杉醇的分离与纯化

摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。

方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。

结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。

关键词红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶目录一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。

................................................. 错误!未定义书签。

（一）液相萃取。

.................................................................................... 错误!未定义书签。

（二）固相萃取法。

............................................................................... 错误!未定义书签。

（三）树脂层析法。

............................................................................... 错误!未定义书签。

（四）活性炭脱色。

............................................................................... 错误!未定义书签。

（五）硅胶正向层析。

.......................................................................... 错误!未定义书签。

（六）结晶纯化。

.................................................................................... 错误!未定义书签。

红豆杉中紫杉醇抗癌研究进展

现代中西医结合杂志Ｍ。ｅｎ０ｍａｏＩｔｒｔｒｄｉＩｌｈｎｓｎｓｒｄｉｅ０８Ｄｃ７３）ｄｒｕ１ｆｎｅａｄＴａｉ。ａｃｉｅｅｄｗｅｔｎＭｅｉｎ０ｅ，１（５Ｊｇｅｔ１ａｅｃ２
红豆杉中紫杉醇抗癌研究进展
ＤＢ的反应为连串反应，时问和温度影响较大。当反应温Ａ）受
北红豆杉及云南红豆杉次之。
杉（ａｕｈｎｍｉｐｇｒＲｈ）的树皮中分离得到的双萜Ｔｘｓｅｓ（ｌｅ）ｅｄ树ｃｓｉ类天然产物，杉醇及紫杉烷类化合物不仅可治疗常规化疗紫无效的卵巢癌、腺癌和非小细胞肺癌，且对食管癌、颈乳而头癌等其他一些恶性肿瘤也有一定疗效。其作用机制一方面在于紫杉醇是一种细胞周期特异性药物，通过稳定微管防止可其解聚，导有丝分裂长期阻滞于Ｇ／期而使细胞出现分诱２Ｍ裂性死亡；一方面还在于其可采用ｃｓａｅ另ａｐｓ一３依赖性等独立于其细胞分裂阻滞作用的机制诱导肿瘤细胞的凋亡ｌ１】Ｊ。
要分布于北半球，国有４种１种，要分布于甘肃、西、我变主陕
安徽、湖北、南、西、州、湖广贵四川、南等省区一。研究表云卜

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net　第20卷第12期2008年12月化学研究与应用ChemicalResearchandApplicationVol.20,No.12Dec.,2008　收稿日期:2008204215;修回日期:2008207218

基金项目:中南大学研究生教育创新工程项目(1343277330,1343277228

)

联系人简介:满瑞林(19552),男,教授,研究方向:精细化工及新型分离技术。Email:rlman@mail1csu1edu1cn

文章编号:100421656(2008)1221637204

曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的超声提取研究

满瑞林3,乔亮杰,倪网东

(中南大学化学化工学院,湖南　长沙,410083)

摘要:研究了曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的超声浸提,通过液液萃取对粗提物进行二次纯化,用高效液相色谱检测紫杉醇的含量。试验确定紫杉醇的最佳浸提工艺条件为:浸提时间:90min(三次浸提,30min/次);温度:50℃;原料粒径:01180～01120mm。最佳工艺条件下用1010g原料提取得到的010465g浸膏中,紫杉醇质量浓度为61182%。关键词:曼地亚红豆杉;超声浸提;紫杉醇;高效液相色谱。中图分类号:O62919 文献标识码:A

紫杉醇(taxol)是一种具有抗癌活性的二萜类化合物,是继阿霉素和顺铂后最热点的抗癌新药,

被认为是近二十年来天然抗癌领域的重大发现[1]。紫杉醇的主要来源为天然红豆杉属植物。曼地亚红豆杉是红豆杉属常绿灌木植物,其生长速度快,植株利用率高,适应能力强,生物特性稳定,被美国FAD批准为提取紫杉醇首选的红豆杉品种之一[2]。如今国内大量引种该物种,原料易得。目前紫杉醇多以红豆杉属植物体为原料,经提取分离纯化得到。在紫杉醇的粗提阶段,溶剂浸提最为普遍。李春斌等[3]用乙酸乙酯和丙酮(体积比1:1)的混合溶液作溶媒,对红豆杉中紫

杉醇的普通浸提和索氏提取进行了对比试验,提取时间分别为48h和8h;郑广乐[4]等用95%的乙醇处理云南红豆杉,冷浸24h后超声提取2h,基本可把紫杉醇提取完全。为了缩短紫杉醇粗提阶段的提取时间,提高提取分离效率,研究人员探索采用固相萃取、超声提取、超临界流体萃取[5210]等手段来强化提取过程,缩短提取时间,展现良好发展前景。但它们多处于研究的初级阶段,探索深度不够。为此,本文就超声浸提在紫杉醇粗提中的应用做了较全面、系统的研究,通过液液萃取对紫杉醇粗提物进行二次纯化,用高效液相色谱检测紫杉醇的含量,从而确定超声浸提在紫杉醇粗提中的最佳工艺条件。

1　实验部分111　仪器与试剂FZ102微型植物试样粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);KQ2200DB型数控超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司);752S紫外2可见分光

光度计(上海棱光技术有限公司);AUY220型电子分析天平(SHIMADZU);R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);SHB-IV双A循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DHG29070

型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);高效液相色谱仪(SHIMADZU,2010A,检测器SPD2M10AVP)。紫杉醇对照品(上海同田生物科技有限公司,

纯度>98%);溶媒(乙酸乙酯与丙酮混合液,体积比为1:1);甲醇,三氯甲烷,石油醚,硫酸铵均为分析纯;曼地亚红豆杉植株(紫杉醇平均含量不高于万分之四,浙江常山曼地亚红豆杉培植基地)。112　实验方法11211　色谱条件的选择色谱柱:phenomenexC18(250mm×416mm,

化学研究与应用第20卷准确称取紫杉醇标准品510mg,用甲醇定容于50mL容量瓶中,制成100μg/mL的紫杉醇储备液。分别准确量取015、110、210、410、610、1010mL储备液于10mL容量瓶,用甲醇定容至刻度。得到浓度为5、10、10、20、40、60、100μg/mL的系列标准溶液。HPLC检测所得紫杉醇特征峰峰面积与其浓度回归方程为:Y=19391108X+11722175,R=019997。11213　实验步骤将烘干后的曼地亚红豆杉枝条粉碎至一定粒径粉末。试验时,每次称取1010g粉末于250mL三口烧瓶中,分别用60mL、40mL、40mL的溶剂,在一定温度下连续三次超声浸出,超声功率为100W。减压抽滤,滤液合并。将滤液在40℃旋转蒸干,浸膏用甲醇溶解并定容至50mL,然后用50mL石油醚萃取除去该甲醇溶液中所含弱极性杂质(三次,每次30min)。再用50mL三氯甲烷+50mL蒸馏水混合液继续萃取三次。为避免萃取过程的乳化现象,需在萃取体系中加入适量011mol/L的硫酸铵[2]。分离下层三氯甲烷层并旋转蒸干得到膏状物,用甲醇将浸膏溶解并定容至50mL供高效液相色谱测定。2　结果与讨论曼地亚红豆杉枝条的提取率超声浸提受浸提时间、浸提温度及原料粉碎规格等的影响,本文以浸提量为衡量指标,对这些影响因素进行考察。图1　浸提时间与紫杉醇浸提量关系曲线Fig.1　RelativecurvebetweenextractiontimeandthecontentofTaxol211　超声浸提总时间的影响取五份粉碎度为80～120目的原料粉末按试验步骤进行浸提,浸提温度45℃,浸提总时间分别为60min、90min、120min、150min、180min(浸提次数均为三次,每次浸提时间为总时间的1/3)。超声浸提时间与紫杉醇浸提量之间的关系(见图1)表明,随着超声浸提时间的延长,紫杉醇

浸提量增加。当浸提时间超过120min,提取量增加缓慢。综合提取效率、成本等因素,确定最佳总浸提时间为120min。212　超声浸提温度的影响按试验步骤取五份粉碎度为80～120目的原料粉末进行超声提取,浸提总时间为120min(分三次),改变浸提温度为40、45、50、55和60℃。

图2　浸提温度与紫杉醇浸提量关系曲线Fig12　RelativecurvebetweenextractiontemperatureandthecontentofTaxol

浸提温度与紫杉醇浸提量之间的关系(见图2)表明,随着浸提温度的升高,紫杉醇的浸提量逐渐增大,当温度为50℃时,超声浸提所得的粗提物中紫杉醇的浸提量最高。浸提温度进一步升高时,紫杉醇的浸出量下降。紫杉醇属热敏性物质,物理化学性质不稳定,当温度过高时,自身发生化学转化,从而使其含量减少[11]。由此确定最佳提取温度为50℃。213　原料粒径的影响取原料粉末过筛,得四个不同粒径级别:40-

80目、80-120目、120-160目、160-200目。其平均粒径分别为01250mm(60目)、01154mm(100

目)、01110mm(140目)、01080mm(180目),本文对这四个级别的原料粉末样品进行考察。控制提取总时间120min(分三次),提取温度50℃。

第12期满瑞林等:曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的超声提取研究图3　原料平均粒径与紫杉醇浸提量关系曲线Fig13　RelativecurvebetweentheaveragegranularityofrawmaterialandthecontentofTaxol原料粒径与紫杉醇浸提量之间的关系(见

图3)表明,原料平均粒径在01154mm时,超声浸提所得的浸膏中紫杉醇浸提量最高,已超过2800μg。紫杉醇浸提过程为:溶媒从液相体系经过固液界面

进入固相体系,然后携可溶于溶媒的物质经固液界面再到达液相体系。原料粉末粒径较大时,紫杉醇从原料进入溶媒的传质阻力较大,故浸提量低;原料粉末粒径较小时,粉末易聚积成团,影响紫杉醇的传质速率。由此确定最佳原料粉碎粒径为01154mm左右。214　最佳工艺条件试验以上试验确定紫杉醇的最佳浸提工艺条件为:浸提时间:90min(三次浸提,30min/次);温度:

50℃;原料粒径:01180～01120mm。现用1010g原料进行了浸提试验,得到得紫杉醇浸膏量为010465g,浸膏中紫杉醇的量为218745mg,质量浓度为61182%。紫杉醇富集较好。浸膏试样以及紫杉醇标准品的高效液相谱图见图4。由图,保留时间为141350min的峰为紫杉醇的特征峰。

(a)(b)图4　紫杉醇标准品液相色谱图(a)与紫杉醇浸膏液相色谱图(b)Fig14　Chromatogramoftaxolstandardsample(a)andChromatogramoftaxollixivium(b)

215　加标回收试验为了进一步考查本试验分析方法的可靠性,精确量取浓度为10、0、40、60、100μg/mL的紫杉醇标准溶液各1mL加入到五份等量的被测试样中做加标回收试验。回收率和相对标准偏差值见表1。

9361