基因差异表达(Differential Gene Expression)
单细胞转录组测序数据分析方法
单细胞转录组测序数据分析方法单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种能够测量每个细胞内大量基因表达的技术。
与传统的全组细胞转录组测序相比，scRNA-seq可以更细致地研究不同表型细胞的异质性，从而深入了解细胞发育、组织构建以及疾病的发病机制。
然而，由于单细胞转录组数据规模庞大，独特的数据结构和差异化的表达模式，分析这些数据也面临着挑战。
下面将介绍几种常见的单细胞转录组测序数据分析方法。
1. 数据预处理在进行单细胞转录组测序数据分析之前，首先需要对原始数据进行预处理。
常见的预处理步骤包括去除低质量的细胞、去除批次效应、进行基因表达量的归一化以及异常值的处理。
去除低质量的细胞通常可以根据细胞的表达量进行筛选。
在大多数情况下，保留表达量高于一定阈值的细胞可以有效去除噪音和低质量的数据。
批次效应是由不同实验批次或处理过程引入的技术差异。
为了消除批次效应对分析结果的影响，可以应用一些统计方法，例如ComBat算法，对数据进行批次校正。
基因表达量的归一化是将不同细胞之间、不同基因之间的表达量进行统一的过程。
常见的归一化方法有TPM (Transcripts Per Million)、FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)以及CPM (Counts per Million)等。
异常值的处理是要将表达量异常的基因或细胞进行处理，以保证数据的准确性。
一种常见的方法是将异常值置为缺失值或使用统计方法进行调整。
2. 细胞聚类细胞聚类是将单细胞数据根据其表达模式的相似性进行分组的方法。
通过聚类分析，我们可以将同一类型细胞的数据聚集在一起，便于后续的细胞识别和功能注释。
常见的细胞聚类算法包括K-means、层次聚类（hierarchical clustering）、DBSCAN（Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise）等。
东南大学农学院2021级《细胞生物学》考试试卷(1365)
东南大学农学院2021级《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（35分，每题5分）1. 细胞中所有的微丝均为动态结构。
（）答案：错误解析：体内有些微丝并不是动态的结构中，而是区鲁的结构，如肌肉中的细丝及肠上皮细胞微绒毛中的轴心微丝。
2. 细胞质基质之中的蛋白质都呈溶解状存在。
（）答案：错误解析：在细胞质细胞核基质中的多数蛋白质包括水溶性蛋白质，并不是以溶解状况存在的，而是直接或间接细胞质骨架结合或与生物膜结合。
3. 经过流式细胞仪分离出来的细胞不能继续培养。
（）答案：错误解析：如果染色过程不冲击细胞活性，经流式细胞仪分离出来的细胞可以继续培养。
4. 哺乳动物受精卵在发生卵裂到16细胞前，所有细胞都是全能细胞。
（）答案：错误解析：哺乳动物紫菊受精卵在发生卵裂到8细胞前，所有细胞都是全能细胞。
5. 含有遗传信息的线粒体和叶绿体，可以在体外培养持续生存。
（）答案：错误解析：从细胞分离出的任何结构设计，都不能在体外培养持续不了生存，不用作为生命活动的基本单位不必而存在。
6. 细胞分化是选择性基因表达的结果，所以受精卵中不同的区域表达不同组织的专一性基因。
（）答案：正确解析：受精卵细胞中所的细胞质中所，物质分布是不表层的，正是这种分配不公一分布决定后期了细胞的早期分化。
7. 细胞内一种蛋白质总量是否处于稳定状态，取决于其合成速率、催化活性以及降解速率。
（）答案：错误解析：蛋白质的含量取决于合成和降解的比率，而与催化活性无关。
2、名词解释（40分，每题5分）1. facilitated diffusion[武汉科技大学2019研]答案：facilitated diffusion的中文名称是协助扩散。
协助扩散又称“促进扩散”或“易化扩散”，是细胞膜被动运输物质的一些则形式。
功能基因组学统计方法
功能基因组学统计方法是指用于研究基因功能和蛋白质互作关系的统计学方法。
其中包括了许多不同的算法，如:
●差异表达分析（Differential Expression Analysis）:利用基因表达数据来发现在不同组织或疾病状态
下表达水平有显著差异的基因。
●基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis）:利用差异表达基因的集合来发现富集在某些生物学
过程或疾病中的基因。
●基因本体论分析（Gene Ontology Analysis）:利用基因的生物学功能注释来发现富集在某些生物学过程
或疾病中的基因。
●蛋白质互作网络分析（Protein Interaction Network Analysis）:利用蛋白质互作数据来发现差异表达
基因之间的相互作用关系。
●转录组关联分析（Transcriptome Wide Association Analysis）:利用基因表达数据来发现与某疾病相
关的基因。
这些方法通常需要大量的基因组数据，并结合生物学背景知识来进行分析。
tcga某个基因差异表达
tcga某个基因差异表达TCGA基因差异表达研究及其在肿瘤疾病中的应用引言：基因差异表达是指在不同组织、细胞或生理状态下，基因表达水平的差异。
TCGA（The Cancer Genome Atlas）项目是一个全球性的癌症基因组研究计划，旨在通过分析多种癌症类型的基因组数据，揭示癌症的发生机制和靶向治疗的潜在靶点。
本文将以TCGA某个基因差异表达为标题，探讨基因差异表达在肿瘤疾病中的应用。
第一节：基因差异表达的意义和方法基因差异表达研究可以帮助我们理解基因与表型之间的关系，揭示不同基因在不同条件下的表达模式，从而为疾病的发生机制和治疗提供重要线索。
常用的基因差异表达分析方法包括RNA测序和芯片技术，通过对样本中的RNA进行定量测量，得到基因的表达水平数据。
第二节：TCGA项目简介TCGA项目是一个多中心的合作研究项目，旨在通过对多种癌症类型的基因组数据进行系统分析，揭示癌症的分子特征和治疗靶点。
该项目利用高通量测序技术和其他生物信息学方法，对数千个癌症样本进行基因组测序，构建了一个庞大的癌症基因组数据库。
第三节：基因差异表达在肿瘤疾病中的应用基因差异表达在肿瘤疾病中有着广泛的应用。
首先，基因差异表达可以帮助我们发现新的肿瘤标志物。
通过比较肿瘤组织和正常组织中的基因表达差异，可以筛选出在肿瘤中高度表达的基因，并进一步验证其作为肿瘤标志物的潜力。
基因差异表达可以帮助我们理解肿瘤发生发展的分子机制。
通过比较不同肿瘤类型或不同分期的肿瘤组织中的基因表达差异，可以揭示不同类型和分期的肿瘤之间的分子差异，从而有助于我们理解肿瘤的发生和发展过程。
基因差异表达可以帮助我们预测肿瘤的预后和治疗反应。
通过分析肿瘤组织中的基因表达差异，可以建立预后模型和治疗响应模型，从而预测患者的生存期和对治疗的反应。
第四节：基因差异表达的挑战和解决方案基因差异表达研究面临着一些挑战，例如样本数量少、数据处理复杂等。
为了克服这些问题，研究者可以通过增加样本数量、使用更加精确的测序技术和开发更加有效的数据处理算法来提高研究的可靠性和准确性。
多样本 差异基因-概述说明以及解释
多样本差异基因-概述说明以及解释1.引言1.1 概述多样本差异基因分析是一种重要的生物信息学方法，用于研究不同样本之间基因表达水平的差异。
随着高通量测序技术的发展，我们能够同时获得大量样本的基因表达谱，从而更好地理解基因表达调控在不同生物体中的变化。
在过去的几十年里，通过比较两个样本的基因表达差异，人们已经发现了许多与疾病、发育和环境适应等有关的基因，这些差异基因对于我们探索生命活动的机制和疾病的发生发展具有重要意义。
然而，单个样本间的差异分析只能提供有限的信息，无法全面揭示基因表达调控的复杂性。
而多样本差异基因分析方法则可以比较多个样本间的基因表达模式，从而更全面地把握基因表达的变异特点。
多样本差异基因分析方法中最常用的是差异表达分析方法，它通过比较样本间的基因表达水平差异来筛选出差异表达的基因。
除了差异表达分析，还有一些其他方法如差异剪切分析、差异甲基化分析等，可以用于探索基因调控的其他方面。
这些方法的应用范围广泛，不仅可以用于研究基础科学问题，还可以在临床医学中用于疾病的诊断和治疗。
本文将首先介绍多样本差异基因分析的常用方法，包括差异表达分析和其他差异分析方法；随后，将探讨多样本差异基因分析在生物学研究和临床应用中的意义和潜力。
最后，我们将总结多样本差异基因分析的重要性，并展望未来该领域的发展方向。
通过本文的阅读，希望读者能够对多样本差异基因分析有一个全面的了解，并认识到它在生命科学研究和医学应用中的重要性和前景。
同时，也希望能够进一步促进多样本差异基因分析方法的发展，不断推动生物学研究和医学进步的步伐。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将分为三个主要部分来探讨多样本差异基因的相关内容。
首先，在引言部分将概述本篇文章的主题和背景，并介绍多样本差异基因研究的重要性。
接下来，正文部分将重点讨论多样本差异基因分析的方法和技术，以及多样本差异基因的意义和应用。
最后，在结论部分将总结多样本差异基因研究的重要性，并展望未来多样本差异基因研究的发展方向。
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因
（作者:___________单位:_____ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ_____邮编:___________）
作者：王亚利，王西京，王中卫，金迎迎，李毅
【摘要】目的筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达，探讨鼻咽癌放射抗拒机理。方法用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE2建立放射抗拒性细胞CNE2R，采用BioStarH141s型基因芯片检测CNE2与CNE2R差异表达基因。结果CNE2和CNE2R细胞有差异表达的基因308条，上调176个，下调132个。在差异表达的基因中，有76个位点出现6倍以上的差异，其中36个下调、40个上调，包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因，基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因。结论CNE2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞，在基因水平上发生了某些突变，通过调控其中相关基因，就有可能调控细胞的放射敏感性。
【关键词】鼻咽癌；基因芯片；放射抗拒性
ABSTRACT: Objective To observe the differential gene expression in human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line with different radiosensitivity by cDNA microarray analysis. Methods A radioresistant cell line, CNE2R, was established from a human nasopharyngeal carcinoma cells line CNE2 by repeated Xray irradiation. The differential gene expression of CNE2 and CNE2R was screened with cDNA microarray by BioStarH141s profile gene chip. Results There were expressed 308 genes to be screened out between CNE2R cell line with different radiosensitivity and its parental CNE2 cell line, while 176 upregulated genes in CNE2R cells and 132 downregulated genes were found. In them, there were 40 upregulated ones and 36 downregulated ones whose ratios were higher than 6.0 or lower than 0.1. The different genes included DNA damageand repairrelated genes; cell cyclerelated and cytoskeletonrelated proteins; and apoptosisrelated genes. Conclusion The radioresistant CNE2R cells were isolated from the CNE2 cell line by repeated Xray irradiation. The stable radioresistance is the result of coeffect by polygene and multiple factors, which provide several gene targets to sensitize the radioresistant cells for improving the radiocurability of NPC.
基因差异表达分析
t-Statistic
t x
s/ n
• When the sampled population is normally distributed, the t statistic is Student t distributed with n-1 degrees of freedom.
= t-value
low variability
Determining the p-Value
2.5715.96 0
Z
Area = .005 Area = .025
-1.9-62.575
Area =.005 Area = .025
f(t)
.95
.025
-1.96 0 1.96 t
Assumptions
Right Tail
H0: 1 2 OR H1: 1 < 2
H0: 1 - 2 Left H1: 1 - 2 < 0 Tail
Mean systolic BP in nephritis is significantly higher than of normal person
control group mean
treatment group mean
Is there a difference?
What does difference mean?
medium variability
The mean difference is the same for all three cases
t l 2 . 0 1 2 l 4 2 . 3 5 . 91 20
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The denominator in T becomes really small
Constantly expressed genes show up on top of the list
Correction: Add a constant fudge factor s0
Regularized T-score
Therefore: Invest money in repeated experiments!
A
B
Standard Deviation and Standard Error
Standard Deviation (SD): Variability of the measurement Standard Error (SE): Variability of the mean of several measurements
->Limma
->SAM
->Twilight
More Scores:
- Wilcoxon Score (robust)
- PAUc Score (separation)
- paired t-Score (paired Data)
- F-Score (more then 2 conditions)
- Correlation to a reference gene - etc etc
answer is yes, by up to 500% then
the answer is no.
A cost efficient (cheap) experiment II:
Is a three-fold induced gene more
trust worthy than a two-fold
Ranking means finding the right genes … drawing our attention to them
In many applications it is the most important step
Ranking is not Testing
Ranking: Finding the right genes
higher expression in profile A than
A
in profile B.
Is two-fold trust worthy?
B
Well, by how much can this gene
change in group A and in group B?
By no more than 10% than the
If you want to rank by fold change you compute the average expression in both groups and subtract them.
T-Score
Idea: Take variances into account
Change: low Variance: high
Order due to some score, Frequently T Score
1st: most differential, 2nd: second most diff ...
Which gene is more differentially expressed?
Ranking is Scoring
-> Statistical Analysis
Ranking:
Problem: Produce an ordered list of differentially expressed genes starting with the most up regulated gene and ending with the most down regulated gene
Order due to some score, Intuitively: Fold change
1st: most differential, 2nd: second most diff ...
Testing: Find Genes due to amount of fold change/Score which are significant s.t. there are less than 5% False Positives -> maybe you miss some (False Negatives)
Therefore: Invest money in repeated experiments!
A
B
The additive scale:
You will want to use the wealth of statistical theory to analyze your data - Most statistics works on an additive scale (Significance of differences etc ...) - Gene expression works on a multiplicative scale (fold changes ...)
Actually this depends on the within class variability of the two genes
again, it can be the other way
round.
Is a three-fold induced gene more trust worthy than a two-fold induced gene?
Ranking: Order Genes due to amount of fold change/Score -> maybe some that are not differential in reality (False Positive)
Gene, candidate 1 Gene, candidate 2 Gene, candidate 3 Gene, candidate 4 Gene, candidate 5 Gene, candidate 6 Gene, candidate 7 Gene, candidate 8 Gene, candidate 9 Gene, ....
Differential Gene Expression
Patients, Samples, Timepoints ...
Genes
Two cell/tissue /disease types:
wild-type / mutant control / treated disease A / disease B responding / non responding etc. etc.... For every sample (cell line/patient) we have the expression levels of thousands of genes and the information whether it is A or B
T?
T?
T-Test PROBLEMS
• There are many genes (-> tests) but only few repetitions • is „using s“ a estimate good? • if measured variance is small, T becomes easily very large
Conclusion: Transform your data to the additive
scale -Simple way: take logs
Reminder:
Questions:
Which genes are differentially expressed?
-> Ranking
Are these results „significant“
Testing: Deciding whether genes are significant
There is more then one way to rank
There is more then one way to test
The criteria for which ranking is best is different from the criteria which test is best … power is often no argument
Gene, candidate 1 Gene, candidate 2 Gene, candidate 3 Gene, candidate 4 Gene, candidate 5 Gene, candidate 6 Gene, candidate 7 Gene, candidate 8 Gene, candidate 9 Gene, ....
You need to score differential gene expression Different scores lead to different rankings What scores are there?
Fold Change & Log Ratios
You have transformed your data to additive scale! Factors become differences:
Change: high Variance: low
Change: high Variance:high
Change: HIGH Variance: SMALL
Change: SMALL Variance: HIGH
T huge