基因表达差异2
差异表达分析-DESeq2代码
差异表达分析是RNA-seq数据分析中的常见步骤，常常用来找出两组或多组样本间表达有显著差异的基因。
下面是一个基本的差异表达分析的R语言代码示例，这里使用了DESeq2包。
首先，你需要安装和加载必要的R包。
如果你尚未安装这些包，可以使用以下代码进行安装：R复制代码if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))install.packages("BiocManager")BiocManager::install("DESeq2")加载包：R复制代码library("DESeq2")接着，你需要读入你的数据。
这里假设你已经有一个表格，其中每一行代表一个基因，每一列代表一个样本，数据是基因在样本中的表达量（计数数据）。
你的数据可能像这样：R复制代码# 创建一个示例数据框set.seed(123) # 设置随机种子以便重复df <- data.frame(gene = rep(1:10, each = 3), # 10个基因，每个基因有3个样本sample1 = rpois(10, 10), # 用泊松分布随机生成表达量sample2 = rpois(10, 15),sample3 = rpois(10, 20))然后，你需要创建一个元数据框，描述你的样本（比如样本的条件，批次等）。
例如：R复制代码# 创建一个示例元数据框metadata <- data.frame(condition = factor(rep(c("control", "treated"), each = 3)) # 两种条件，每种条件有3个样本)然后你可以使用DESeqDataSetFromMatrix函数来创建一个DESeqDataSet对象，这个对象可以用于差异表达分析：R复制代码dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = df,colData = metadata,design = ~ condition)最后，你可以运行差异表达分析：R复制代码dds <- DESeq(dds)然后你可以检查结果，找出显著差异的基因：R复制代码res <- results(dds)head(res[order(res$padj),]) # 显示调整后的p值最小的结果。
基于转录组数据的差异表达基因分析
基于转录组数据的差异表达基因分析转录组（transcriptome）是指一个生物在一定时间和环境下其全体细胞内的RNA转录产物的总和，即所有可以转录的基因产物，包括编码RNA和非编码RNA。
转录组分析（transcriptome analysis）是一种研究基因表达级别、结构和调控机制的手段，通过对RNA测序数据的研究，可以更好地理解生物体内基因的调控规律和生命活动的本质。
其中，差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析是转录组分析的一种重要方法，可以帮助我们研究基因的功能和作用，深入探究生物组织和功能间的关系。
一、差异表达基因的概念差异表达基因是指在相同条件下两种或多种样本中差异表达的基因，即其表达水平在不同样本中差异显著，这种差异有时也称为基因表达的变化或调控。
常用的方法是对不同样本中的转录组进行测序，获得每个基因的表达量，再通过各种差异分析方法，筛选出差异表达的基因，这些基因可能具有重要的生物学功能，可以在不同种类的研究中得到应用。
二、差异表达基因分析的步骤差异表达基因分析一般包括以下步骤：1. 数据处理：包括数据清洗、对齐和定量等步骤。
转录组测序数据从测序平台获取后需要进行数据清洗，包括去除低质量的序列、去除污染序列和引物序列等。
然后需要将原始序列数据对齐到参考基因组或类似序列上，例如转录本、参考转录本或参考基因组等。
最后，需要计算每个基因或转录本在各样本中的表达量，可以通过HTSeq、Cufflinks、RSEM等软件或者简单的读数对齐统计表达量。
2. 差异表达基因筛选：筛选出在不同样本间表达量差异显著的基因。
差异表达基因筛选是转录组分析的重要步骤之一，它可以将表达水平差异显著的基因筛选出来，对于研究基因的生物学功能、分子机制以及生物学意义都非常重要。
目前，常用的差异分析方法包括DESeq2、EdgeR、Limma、Cuffdiff等。
通过统计学方法和多重检验校正，可以筛选出不同样本中具有显著表达水平差异的基因。
基因差异表达技术
基因差异表达技术真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。
高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。
其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。
生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。
由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。
研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display，DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。
一、差别杂交与扣除杂交差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。
为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。
相对定量方法PCR技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异
利用实时定量 PCR 技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异Kenneth J. Livak and Thomas D. SchmittgenDepartment of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy.Washington State University, Washington 99164-6534现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2 - △△ CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△ CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录 PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （ RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 － 3 ）。
实时 PCR 技术和 RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（ 4 ， 5 ）。
实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 － 9 ），包括已发表的两篇研究论文（ 10 ， 11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝 / 细胞增加到 2500 拷贝 / 细胞更加直观。
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
差异表达基因分析
单张cDNA芯片差异表达基因
差异表达基因分析
基因表达谱芯片实验的主要目的之一是发现两个 样本间差异表达基因。 通常采用基因在实验组和对照组中信号的比值作 为衡量基因在两种状态下基因的表达差异，在双 色荧光系统中，用Cy5/Cy3的比值来衡量基因的 表达差异，也称表达差异值。在Affymetrix等短 的寡核苷酸芯片中，采用单色荧光标记的方式， 实验组和对照组分别用两张芯片进行检测，表达 差异值即为两张芯片的信号比值。 噪声和芯片本身的一些因素以及生物学本身的特 点给筛选差异表达基因带来了很大的麻烦。必须 设定一个差异表达基因的判定标准。这个筛选的 标准就称为差异表达基因的阈值。
一般性的方法
选择一个统计量给基因排秩来证明表达有 差异 为排秩统计量选择一个判别值，在它之上 的值将被认为是显著的 前面一个部分更为重要，所以研究的较多， 方法也更多，后面那部分的方法稍微简单
重复芯片（replicates）M值
根据比率平均值或 对基因排序。 M值为 信号强度比值的log2值， 是任一特定基 因在重复序列中M值的均值。
双通道cDNA芯片数据分析用得较多
False Discovery Rate (FDR)
错误发现率是评估检验统计显著性的最有 力工具。统计学家都想用更符合统计学的 手段得到差异基因，具体说来就是想用假 设检验后赋予每个基因统计显著性或者P值， 使得每个基因的判别更有统计学上的意义。 为了达到这个目的，统计学家们常常用控 制错误发现率（False Discovery Rate） 的方法来判断差异基因。
降维是指将样 本从输入空间 通过线性或非 线性映射到一 个低维空间。 降维可以减少无用信息和冗余信息，将高维数据转换 为易于处理的低维数据，减少了后续步骤处理的计算量 ，当降至三维以下时还可用于可视化技术，从而发挥人 在低维空间感知上的优点，发现数据集的空间分布、聚 类性质等结构特征。
差异表达基因分析：差异倍数（foldchange）,差异的显著性（P-value）火山图
差异表达基因分析：差异倍数（foldchange）,差异的显著性（P-value）⽕⼭图Differential gene expression analysis：差异表达基因分析Differentially expressed gene (DEG)：差异表达基因Volcano Plot：⽕⼭图差异倍数(fold change)fold change翻译过来就是倍数变化，假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。
⼀般我们都⽤count、TPM或FPKM来衡量基因表达⽔平，所以基因表达值肯定是⾮负数，那么fold change的取值就是(0, +∞).为什么我们经常看到差异基因⾥负数代表下调、正数代表上调？因为我们⽤了log2 fold change。
当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就⼤于1，log2 fold change就⼤于0（见下图），B相对A就是上调；当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就⼩于1，log2 fold change就⼩于0。
通常为了防⽌取log2时产⽣NA，我们会给表达值加1（或者⼀个极⼩的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要⼀点对数函数的基础知识】为什么不直接⽤表达之差，差直接有正负啊？假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接⽤差B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；⽤log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 通过测序观察我们发现，不同基因在细胞⾥的表达差异⾮常巨⼤，所以直接⽤差显然不合适，⽤log2 fold change更能表⽰相对的变化趋势。
虽然⼤家都在⽤log2 fold change，但显然也是有缺点的：⼀、到底是5到10的变化⼤，还是100到120的变化⼤？⼆、5到10可能是由于技术误差导致的。
生物信息学中的基因表达数据分析
生物信息学中的基因表达数据分析随着生物学研究的日益深入，人类了解生命的本质越来越多。
而在这个过程中，生物信息学成为了不可或缺的重要工具。
基因表达数据分析是生物信息学中的一个重要研究领域，通过对基因表达数据的处理和分析，可以更好地理解生物体内基因调控网络的功能和生理功能。
下面，我们将着重探讨如何在生物信息学中进行基因表达数据分析。
1.基因表达量数据及其预处理基因表达量是描述一个生物体内基因表达水平的重要参数，包括mRNA，蛋白质表达等。
为了得到准确的基因表达量数据，需要进行一系列的预处理工作。
预处理的主要目的是去除不必要的噪声和误差，使数据更加可靠，便于后续分析。
常见的预处理方法包括：标准化、去除批次效应、数据过滤和基因注释等。
标准化是将原始数据转换为相对基因表达量的过程。
常见的标准化方法包括平均值归一化(Median centering)，最小二乘回归（Least squares regression）等。
除了标准化之外，批次效应也是数据分析中的常见问题。
批次效应是指由于实验过程中不同的实验条件，导致基因表达量发生变化的现象。
去除批次效应可以使数据更加可靠，更能反映生物体内基因调控网络的真实情况。
常见的方法包括ComBat调整和SVA调整等。
2.差异表达分析差异表达分析是生物信息学中最常用的分析方法之一，主要用于比较不同实验组之间基因表达量的差异。
差异表达分析可以帮助我们确定可能存在的关键调控基因，进一步揭示生物体内基因调控网络的机制。
在进行差异表达分析时，我们需要先进行样本分组，将生物样本按组进行分类。
常见的分类方法包括对照组和实验组，或者对两个不同实验组之间进行对比。
接下来，我们需要对基因表达数据进行统计分析。
通常采用的方法包括t检验，方差分析（ANOVA）、贝叶斯方法等。
统计分析的结果会给我们提供差异表达的在显著性水平上的P值。
（P值是检验样本均值是否存在显著性差异的重要指标）。
差异表达分析的结果通常表现为一个差异表达基因列表。
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那么思考一下：什么导致基因在转录水平的调控 表达呢？
三种不同的策略指导细胞在发育过 程中表达不同的基因组合
一、mRNA定位(mRNA localization）
二、细胞---细胞接触（cell-to-cell contact)
三、分泌信号分子扩散转到
Байду номын сангаас
一、mRNA定位(mRNA localization）
细胞骨架固有的极性使某些RNA在卵细胞和胚胎中 被定位化
使两个相同遗传背景的 子细胞得到不同量的调
细胞表现不同性的策略 节分子从而在发育过程
之一:在细胞分裂过程中 中经历不同的过程。
使关键的调节分子(mRNA) 非对称性分配。
受精
（调节分子：由RNA结合 蛋白和信号转导分子编 码常见的是转录活化子 和抑制子。)
和细胞分泌的信号分子都会激发相邻细胞基 因表达的变化
和细胞分泌的信号分子都会
基因表达差异的比较分析是在 转录水平上鉴别组织或细胞间 基因表达与否和基因表达量差 异的技术 ,是揭示生物体发育 和分化机理最有效的途径 ,在 疾病相关基因分离等研究领域 有极广泛的应用 ,是基因组学
研究的核心领域之
谢谢
未受精 均一分布的RNA
受精卵中 定位化的RNA
二、细胞-细胞接触
细胞-细胞接触的信号分子激发相邻细胞基因表 达的变化
一个细胞可以通过产生细胞外信号蛋白来影响 相邻细胞的基因表达，这些蛋白质合成后或者沉 积在细胞膜上，特定信号经由接受细胞表面的受 体识别，受体在结合了信号分子后，启动接受细 胞基因表达的变化。这种细胞表面受体到细胞核 的通讯常常涉及信号传导途径。有时，配体和受 体的结合会触发一系列酶反应并最终修饰核内的 调节蛋白（图
奢侈基因与各类细胞的特殊性有直接的关系, 指导合成组织特异性，对分化有重要影响， 即组织特异性表达的基因
基因的差异性表达决定:
细胞的生长、发育、衰老乃至死亡。
二、基因差异性表达所需的方式
基因表达调控：
可发生在基因表达的任何时期，但主要表 现在转录水平上的调控
基因调控的指挥系统不同的生物使用不同 的信号来指挥基因以达调控
基因差异性表达
一、基因差异性表达所需的基因
分化的细胞虽然保留了全套的遗传信息，但只有某 些基因得到表达，即细胞分化主要是组织特异性基 因中某些种(或某些)特定基因的选择性表达的结果， 这些蛋白和分化细胞的特异性状密切相关，但不是 细胞基本生命活动必不可少的。研究证明，细胞分 化是奢侈基因按一定顺序表达的结果，表达的基因 数约占基因总数的5％～10％。
原核生物中，营养状况和环境因素
如:色氨酸操纵子的负控阻遏调控
真核生物尤其是高等真核生物中，主要为激 素水平和发育阶段，营养和环境因素的影响 力大为下降
发育的基因调控
人体有约200多种不同的细胞类型，但他们都来 自一个共同的细胞－受精卵，这些有相同遗传背 景的细胞通过在发育过程中的不同系列的基因的 表达而彼此不同。
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也就是说，某些特定奢侈基因表达的结果生 成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表 达的结果导致出现另一类型的分化细胞。另 外，分化细胞间的差异往往是一群基因表达 的差异，而不仅仅是一个基因表达的差异。 在基因的差异表达中，包括结构基因和调节 基因的差异表达，差异表达的结构基因受组 织特异性表达的调控基因的调节。