第七讲_差异表达基因分析 共64页
转录组数据分析中的差异表达基因确定方法
转录组数据分析中的差异表达基因确定方法转录组数据分析是研究生物体内转录过程的全基因表达情况的一个重要手段。
通过分析转录组数据，我们可以确定哪些基因在不同条件下表达水平发生了显著变化。
这些差异表达的基因被认为与不同条件下生物体功能的变化密切相关。
因此，确定差异表达基因是理解生物体适应和响应各种条件变化的关键。
在转录组数据中确定差异表达基因，一般需要经历如下几个步骤：1. 数据预处理：首先，需要对原始的转录组数据进行质量控制和过滤。
通过质量控制，我们可以评估数据的准确性和可靠性。
而通过过滤掉低质量的数据，可以提高后续分析的可靠性和准确性。
常用的预处理方法包括去除低质量的读段、去除低质量的碱基、去除接头序列及低质量的5'和3'端。
2. 对齐与定量：第二步是将预处理后的转录组数据与参考基因组对齐，将reads与参考基因组相匹配。
目前常用的对齐工具包括Tophat、STAR等。
通过对齐，可以获得每个基因在样本中的表达量。
常见的定量软件包括HTSeq和Cufflinks等。
3. 差异表达分析：差异表达分析是转录组数据分析的核心步骤。
根据不同的实验设计和假设，可以选择不同的差异表达分析方法。
常见的差异表达基因分析方法包括DESeq2、edgeR、limma等。
这些方法在统计学模型的基础上，使用不同的假设检验方法来寻找表达差异显著的基因。
通常会计算差异倍数（Fold Change）和调整的p值。
4. 功能注释与富集分析：确定差异表达基因后，将这些基因进行进一步的功能注释和富集分析是继续研究的重要一步。
功能注释通过查询数据库（如Gene Ontology和KEGG）来了解差异基因的功能和通路信息。
富集分析则通过比较差异表达基因与全基因组之间的差异，找出在特定功能和通路上显著富集的基因。
这些注释和富集结果能够帮助我们了解差异表达基因的生物学意义。
除了上述的常见分析步骤，根据具体的研究问题，还可以采用其他附加分析方法，如构建共表达网络、进行重要转录因子的分析等，来进一步挖掘差异表达基因的潜在功能。
基因表达差异的分析方法研究
基因表达差异的分析方法研究基因表达差异是指在不同生物或不同条件下，对同一基因进行的表达实验中，所测得的表达量之间的差异。
对基因表达差异的研究可以帮助我们更好地理解基因功能和调控机制，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
接下来，将介绍一些基因表达差异分析的方法。
1. 微阵列技术微阵列技术是最早被用于基因表达差异分析的方法之一。
该技术利用DNA芯片上固定的互补DNA序列与待测RNA样品进行杂交，测定样品中各个基因的表达水平。
具体操作步骤包括：样品采集、RNA提取、标记、杂交与扫描等多个步骤。
虽然微阵列技术具有高通量、高灵敏度和高精度等优点，但也存在着成本高、样品处理复杂和标记的局限性等问题。
2. RNA测序技术随着二代测序技术的发展，RNA测序技术已成为一种常用的基因表达差异分析方法。
RNA测序技术利用高通量测序平台对RNA样品进行测序，可以对基因的转录和剪切等过程进行全面的检测和定量。
与微阵列技术相比，RNA测序技术不需要依赖于基因组序列信息，同时还可以检测未知序列和新基因的表达情况。
但RNA测序技术也存在着不同的测序深度和质量、样品处理和分析方法等影响分析结果的因素。
3. 质谱技术质谱技术是一种基于蛋白质组学的方法，也可以用于基因表达差异的分析。
该技术主要包括两个步骤：蛋白质消化和质谱分析。
在蛋白质消化步骤中，蛋白样品被加入胰酶等酶类，将多肽生成后进行分离。
在质谱分析中，分离后的多肽样品被注入质谱仪，得到其质量和放电荷比例的信息。
由此可以推断出蛋白的氨基酸组成和序列等信息。
质谱技术的优点包括定量、选择性和灵敏度高，同时可以进行定量分析和鉴别分析。
4. 基因编辑技术随着基因编辑技术的发展，我们还可以通过CRISPR-Cas等技术对基因表达差异进行分析。
在这种方法中，我们可以将CRISPR-Cas系统引导的RNA处理后注入细胞内，选择性地打靶并对目标基因进行编辑，从而直接体现基因在表达水平上的变化。
【转录组入门】7：差异基因分析
【转录组⼊门】7：差异基因分析作业要求：使⽤R语⾔，载⼊表达矩阵，然后设置好分组信息，统⼀⽤DEseq2进⾏差异分析，当然也可以⾛⾛edgeR或者limma的voom流程。
基本任务是得到差异分析结果，进阶任务是⽐较多个差异分析结果的异同点。
【1】安装DESeq21 # 下⾯是在R语⾔中操作2 # 载⼊安装⼯具3 > source("/biocLite.R")4 # 安装包5 > biocLite("DESeq2")6 # 载⼊包7 > library("DESeq2")DESeq2对于输⼊数据的要求：1.DEseq2要求输⼊数据是由整数组成的矩阵。
2.DESeq2要求矩阵是没有标准化的。
【2】DESeq2进⾏差异表达分析DESeq2分析差异表达基因简单来说只有三步：构建dds矩阵，标准化，以及进⾏差异分析。
# dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = coldata, design= ~ batch + condition) #~在R⾥⾯⽤于构建公式对象，~左边为因变量，右边为⾃变量。
# dds <- DESeq(dds) #标准化# res <- results(dds, contrast=c("condition","treated","control")) #差异分析结果【3】构建dds矩阵1 > library(DESeq2) # 加载包2 > countData <- raw_count_filter[2:7] # 中括号中的数量要与condition中数量⼀致3 > condition <- factor(c("control","control","control","hypoxia","hypoxia","hypoxia"))4 > colData <- data.frame(s=colnames(countData),condition)5 # raw_count_filter：是所有样品的count按照gene id融合后⽣成的矩阵。
生物信息学中的差异表达基因分析方法研究
生物信息学中的差异表达基因分析方法研究随着高通量测序技术的发展，基因表达谱数据量急剧增加。
为了研究生物体在不同生理状态下基因表达的变化，需要对这些数据进行差异表达基因分析。
差异表达基因分析方法是生物信息学领域的一个研究热点，它可以帮助研究人员深入了解基因表达与功能的关系，探究生物学中的各种生理和病理过程的机理。
差异表达基因分析方法的基本流程差异表达基因分析方法的基本流程包含以下几个步骤。
首先是原始数据的预处理，这一步包括质控、去除低质量序列、去除序列的适配序列和低复杂度序列以及对基因组进行比对等。
接下来就是差异表达基因的鉴定，这一步需要对不同条件下的基因表达进行比较、统计和分析，寻找在不同条件下表达量发生变化的基因。
最后就是差异表达基因的生物信息学分析，如富集分析、通路分析等，用以揭示差异表达基因的生物学功能与代谢通路，为之后的实验设计和结果验证提供思路。
差异表达基因分析方法的主流技术目前差异表达基因分析方法的主流技术有两种：微阵列技术和RNA测序技术。
微阵列技术适用于高通量检测大量基因表达谱情况下的差异表达，但其优缺点并存。
其中由于存储的基因表达谱缺乏深度信息，高度仰赖于探针的准确性，所以其数据分析结果易产生偏差。
因此，相对于微阵列技术，RNA测序技术有着更为准确和精细的差异表达分析。
差异表达基因分析方法的建模差异表达基因分析方法的建模是差异表达分析的重要环节。
目前应用最为广泛的方法是一元线性模型，可以计算每个基因在两个条件下的平均表达量和差异表达的似然比测试。
此外，在数据量小的情况下，二项式模型比一元线性模型更适用于差异表达分析，不同的模型虽然结构不同，但训练结果都可以作为筛选基因的依据。
差异表达基因分析方法的优化为了获得更为准确、细致和可靠的差异表达基因预测结果，需要对于差异表达基因分析方法进行优化。
其中优化方法与技术的选择、算法的运用和评估标准等，都有着深入而细致的研究。
例如，预测差异表达基因的DESeq2算法就是考虑了基因之间的不同，通过多组分组比较实现差异表达基因的筛选，因此DESeq2算法是RNA测序研究中目前最为流行的DE工具之一。
生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧
生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧随着高通量测序和生物芯片技术的发展，差异表达基因分析已成为研究基因调控和识别重要生物过程的关键方法。
差异表达基因筛选是一个常见的分析步骤，它可以帮助研究人员快速发现在不同条件或组织中表达水平显著变化的基因。
本文将讨论生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧，并介绍一些常用的方法和工具。
1. 统计学方法差异表达基因分析的首要任务是确定在两个条件或组织之间是否存在表达水平上的显著差异。
为了实现这一目标，研究人员可以利用各种统计学方法，如T检验、方差分析（ANOVA）、Wilcoxon秩和检验等。
这些方法可以帮助确定差异表达基因，并提供相关的统计指标（如p值和调整后的p值），用于衡量差异的显著性和可靠性。
2. 基因表达聚类基因表达聚类是一种常用的差异表达基因筛选技巧。
通过将基因根据其表达模式进行分组，研究人员可以识别出共同调控的基因群。
常见的聚类方法包括层次聚类、K均值聚类和模糊聚类等。
这些方法可以将差异表达的基因分为若干个独立的模式，有效地揭示基因在不同条件下的表达特征。
3. 基因注释和功能分析差异表达基因筛选的另一个重要步骤是进行基因注释和功能分析。
基因注释可以将差异表达基因与已知的生物学功能和代谢通路关联起来。
研究人员可以利用公共数据库（如Gene Ontology、KEGG和Reactome等）对差异表达基因进行注释和功能分析，以了解这些基因在疾病发生和发展中的潜在作用。
4. 基因网络分析基因网络分析是一种集成基因表达数据的方法，可以帮助研究人员识别差异表达基因之间的相互关系和调控通路。
通过构建基因互作网络或转录调控网络，研究人员可以发现潜在的关键基因和调控因子，并揭示相关生物过程的重要调控机制。
常用的基因网络分析工具包括Cytoscape、STRING和GeneMANIA等。
5. 机器学习方法随着机器学习技术的发展，越来越多的研究人员开始将其应用于差异表达基因筛选。
单细胞转录组基础分析七差异基因富集分析
单细胞转录组基础分析七差异基因富集分析差异基因富集分析是单细胞转录组分析的重要步骤之一，通过对差异表达基因进行富集分析，可以深入了解这些基因的功能和参与的生物过程。
本文将介绍差异基因富集分析的基本原理和常用的分析方法。
差异基因富集分析的基本原理是将差异表达基因与已知的基因功能进行比较，通过统计学方法来确定哪些基因功能在差异基因中富集。
富集分析可以帮助我们理解差异基因在细胞发育、信号通路调控以及疾病发生等方面的功能。
常用的差异基因富集分析方法包括基于基因本体论（Gene Ontology，GO）的富集分析、生化途径富集分析和疾病关联基因富集分析等。
基于GO的富集分析是最常用的富集分析方法之一，通过将差异基因与已知的GO注释进行比较，可以确定哪些GO术语在差异基因中富集。
GO分为三个方面：分子功能、生物过程和细胞组分。
分析时通常会对三个方面进行分析，找出与差异基因富集相关的功能和过程。
GO分析的结果通常以富集因子或者富集P值来表示，富集因子越大或者P值越小，表示差异基因与该功能或过程的关联越显著。
生化途径富集分析是通过将差异基因与已知的生化途径进行比对，来确定差异基因在哪些生化途径中富集。
常用的生化途径数据库包括KEGG和Reactome等。
富集分析通常使用统计学方法，如超几何分布来确定差异基因在生化途径中的富集程度。
富集分析的结果通常以富集因子或者P值来表示，富集因子越大或者P值越小，表示差异基因与该生化途径的关联越显著。
疾病关联基因富集分析是通过将差异基因与已知的疾病关联基因进行比对，来确定差异基因与哪些疾病存在关联。
常用的疾病关联基因数据库包括OMIM和GWAS catalog等。
富集分析通常使用超几何分布或者Fisher精确检验等统计方法来确定差异基因在疾病中的富集程度。
富集分析的结果通常以富集因子或者P值来表示，富集因子越大或者P值越小，表示差异基因与该疾病的关联越显著。
差异基因富集分析的结果通常以图表的形式呈现，如柱状图、饼图和散点图等。
基因表达数据分析中的差异基因识别方法研究
基因表达数据分析中的差异基因识别方法研究随着高通量测序技术的发展，基因表达数据的分析和挖掘成为了生物学研究中的关键环节之一。
在研究基因功能、疾病发生机制以及药物靶点发现等方面，识别差异表达的基因是相当重要的。
本文将探讨基因表达数据分析中的差异基因识别方法的研究。
基因表达数据分析中，差异基因的识别是一个复杂而关键的挑战。
通过比较不同样本之间的基因表达水平，可以发现差异表达的基因，从而揭示细胞过程的变化以及与疾病相关的生物学机制。
然而，由于高通量测序技术的广泛使用，产生了大量的基因表达数据，使得如何准确快速地识别差异基因成为一个急需解决的问题。
传统的差异基因识别方法通常使用统计学方法，如t检验、方差分析和回归模型等。
这些方法易于实施，但对数据的前提假设严格，需要满足数据分布情况的要求。
此外，由于高通量测序数据存在负二项分布、过度离散和零膨胀等特点，传统的统计学方法往往无法准确评估基因表达的差异。
为了克服传统方法的局限性，研究人员提出了许多新的差异基因识别方法。
其中，最常用的方法之一是基于差异表达分析的方法，如EdgeR和DESeq等。
这些方法基于概率模型对数据进行建模，可以更好地适应高通量测序数据的特点。
另外，机器学习方法也被用于差异基因的识别，如随机森林、支持向量机和神经网络等。
这些方法通过构建分类模型来识别差异基因，可以考虑更多的细节和特征，提高识别的准确性。
除了传统的统计学方法和机器学习方法外，差异基因识别方法还可以通过网络分析和功能注释等方法来增强结果的解释性。
在网络分析中，可以通过构建基因共现网络或基因-蛋白质相互作用网络来挖掘差异基因在生物学过程中的功能关联和调控机制。
功能注释则通过利用公共数据库和生物信息学工具来研究差异基因的功能特征，帮助研究人员更好地理解其在生物过程中的作用。
此外，差异基因识别方法还需要与其他数据分析方法相结合，例如基因整合和数据挖掘方法。
基因整合可以将多个来源的基因表达数据整合到一起，增加样本数量，提高结果的可靠性。
测序数据做差异表达基因分析流程
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一般性的方法
选择一个统计量给基因排秩来证明表达有 差异 为排秩统计量选择一个判别值，在它之上 的值将被认为是显著的 前面一个部分更为重要，所以研究的较多， 方法也更多，后面那部分的方法稍微简单
重复芯片（replicates）M值
根据比率平均值或 对基因排序。 M值为 信号强度比值的log2值， 是任一特定基 因在重复序列中M值的均值。
不同类样本差异基因识别
评价一组数的统计量
232.7 198.2 137.7 84.3 218.6 181.5 216.7
87
平均值 标准差
比较多组数的方法
T检验：平均值 F检验： 方差
SAM（significance analysis of microarrays）
单通道Oligo芯 片，尤其是 affymetrix芯片 数据分析用得 较多
Cluster&Treeview软件
Genesis软件
预分析（Pre-Analysis）
重复值合并（ replicate handling ） 数据转换和标准化（data transformation and standardization） 缺失数据处理（ missing value management ） 基因筛选（pattern selection）
双通道cDNA芯片数据分析用得较多
False Discovery Rate (FDR)
错误发现率是评估检验统计显著性的最有 力工具。统计学家都想用更符合统计学的 手段得到差异基因，具体说来就是想用假 设检验后赋予每个基因统计显著性或者P值， 使得每个基因的判别更有统计学上的意义。 为了达到这个目的，统计学家们常常用控 制错误发现率（False Discovery Rate） 的方法来判断差异基因。
倍数法
倍数法
倍数法是比较常用的一种方法，因为比较简单和 直接。 但是，这种方法也是有其重大缺陷的。比如，在 某个实验中，基因表达水平的变化不大，如果选 择判别域值为2倍，则有可能找不到几个差异表达 的基因，假阴性率比较高。但如果是主观缩小判 断域值，又有可能增大假阳性率。 这一方法没有考虑到差异表达的统计显著性。
这一排序法忽略了一个基因在重复实验中 的不同芯片上表达水平的差异程度。例如， 可能某一个基因在某一张芯片上M值很大， 但在其他芯片上M值很小，其实这条基因 并没有差异表达，但由于个别M值的影响， 从而显示出一个差异表达的特性，造成假 阳性。
T值排序
假如一个基因在几张重复芯片的M值都很 小，但是这些M值非常接近，所以s值也非 常小，这样可能会导致t值很大，从而会把 这个本没有差异表达的基因误认为差异表 达。
基因表达数据矩阵 (glass slides)
数据矩阵具体形式
数据形式
数据矩阵,基因数远大于样品数 对任意一个基因来说,样本值是特征值,数据的维数是M 对任意一个样本来说,基因值是特征值,数据的维数是N
聚类时考虑基因之间的相似性，从数学上讲 就是看对应的M维数据之间的相似性
Cluster&Treeview软件
Improved Detection of Differentially Expressed Genes Time series microarray dataset
聚类分析
基因表达数据矩阵 (Affymetrix
GeneChip® oligonucleotide arrays)
sam/ref
Z值法
在一张cDNA芯片上一般都点了很多基因，其实 这些基因中只有很小一部分表达有差异，所以一 般都假设表达的比率值满足正态分布。 Z=(X-µ)/σ. |Z|>=1.96 在寡核苷酸芯片中，芯片上的基因在相应实验条 件下或相应组织中也只是有很小一部分基因有表 达，可以假定强度满足对数正态分布，同样可以 对其作Z变换，使其具有统计意义。 如果实验体系中没有一条差异表达的基因，Z值法 还是会挑选出5％的差异表达基因。这是因为在芯 片实验中，总有一些由于背景噪声产生的假阳性 点。如果实际上实验中有大量的基因发生表达改 变，Z值法还是机械的找出5％的差异表达基因， 丢失了一部分真阳性点。
单张cDNA芯片差异表达基因
差异表达基因分析
基因表达谱芯片实验的主要目的之一是发现两个 样本间差异表达基因。 通常采用基因在实验组和对照组中信号的比值作 为衡量基因在两种状态下基因的表达差异，在双 色荧光系统中，用Cy5/Cy3的比值来衡量基因的 表达差异，也称表达差异值。在Affymetrix等短 的寡核苷酸芯片中，采用单色荧光标记的方式， 实验组和对照组分别用两张芯片进行检测，表达 差异值即为两张芯片的信号比值。 噪声和芯片本身的一些因素以及生物学本身的特 点给筛选差异表达基因带来了很大的麻烦。必须 设定一个差异表达基因的判定标准。这个筛选的 标准就称为差异表达基因的阈值。
第七讲
Quantile Normalization
使每张芯片/通道的强度值有相同的分布 (intensity distribution)
Quantile normalization
Before
Quantile normalization
After
R语言和bioconductor
差异表达基因分析
Multiple test (Pvalue adjustment)
火山图（volcano plot）
Statistical test: Pvalue Fold change: Ratio
其他方法
B-statistics (Smyth,2019) Bayes T-test (Baldi and Long, 2019) SAMROC (Broberg, 2019) Zhao-Pan method (Zhao and Pan, 2019) ……
修正的T值
修正值由样本方差的均数和标准差估计而 得。结果显示：在一个模拟的数据集中， 虽然带有一些经验性质，但用修正t-统计量 给基因排秩比用均数和一般的t-统计量效果 要好。
单通道寡核苷酸芯片差异基因（两 个样本直接比较）
Affymetrix，illumina芯片由于有探针重复，可以利用统计方 法计算出一个统计性的P值或者score值，筛选差异表达基因