色谱法概论

色谱法概论  定义：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。是一种分离技术。  特点：适宜分离多组分的试样，效率高、应用广。  原理：利用各物质（组分）在两相（固定相、流动相）中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。  完成这种分离分析的仪器为色谱仪。K=Cs/Cm

第一节 色谱法的起源、历程及分类 一、 色谱法的起源和发展 二、 色谱法的几个重要术语*  1. 色谱柱（column）在茨威特实验中,装有CaCO3的玻璃管,即是一根色谱柱(是指包括CaCO3的管).  2. 固定相 (stationary phase)在柱内固定不动的一相称固定相,如CaCO3.  3. 流动相(mobile phase)在柱内不断流动的一相,称流动相,如石油醚.  4. 被分离组分（样品）如色素  5. 洗脱将流动相连续不断地加入色谱柱,使之通过固定相,把被分离的物质冲洗出柱的过程,叫洗脱。洗脱是色谱过程中必要而又重要的步骤—选择适宜的流动相、固定相实现分离。  6. 洗脱剂 在洗脱过程中加入色谱柱的流动相即洗脱剂。  7. 洗脱液(流出液)流出色谱柱的溶液,即洗脱液。 二、色谱法分类 （一）按流动相和固定相所处状态分类： 1. 气相色谱（GC）：气体作为流动相 2. 液相色谱（LC）：液体作为流动相 3. 超临界流体色谱（SFC）：以超临界流体作为流动相 （二）按分离机制分类： 1. 吸附色谱：以吸附剂作固定相，有机溶剂作为流动相，利用样品中不同组分在吸附剂上吸附能力的差别，而进行分离的方法。 2. 分配色谱：根据组分在固定液与流动相中溶解度不同而分离。 3.空间排阻色谱：利用大小不同的分子在固定相（凝胶）与流动相中的选择渗透而达到分离的方法。 4.离子交换色谱：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而进行分离的方法。 5.键合相色谱、毛细管电泳等 （三）按操作形式分类： 1. 柱色谱：将固定相装在金属或玻璃色谱柱内或涂渍在柱内壁上而进行分离的方法。 2. 平面色谱： 1） 纸色谱：以滤纸为载体，以纸纤维吸附的水分为固定相，样品点在纸条一端，用流动相展开进行分离和分析的色谱法。 2） 薄层色谱：将吸附剂均匀地铺在玻璃板上形成薄层，分离方法同纸色谱。 (四） 按使用目的分类  分析用：实验室、便携式；分析样品量少  制备用：实验室用、工业用；纯物质制备，如高纯试剂、蛋白质、手性药物拆分和纯化  流程用：工业生产流程在线连续使用 第二节 色谱过程与术语 一、色谱分离依据简介  分离任何物质都要依据它们性质的差异。  例如蒸馏是利用沸点的差异，沉淀、结晶是利用溶解度不同。  在色谱当中，是利用物质在两相中溶解、亲和、吸附或其它亲和作用力的不同，使混合物中各组分达到了分离。  例如：分离含A、B两种组分的混合溶液。  当组分进入柱后，由于组分与固定相间的亲合力，就要被固定相所滞留，即固定相对组分有滞留作用（保留作用），组分的性质不同，则固定相对不同组分的滞留能力（保留能力）不同。  组分与固定相之间的亲合力越大，则固定相对该组分的滞留越强烈。它随流动相移动的速度就较慢；反之，组分在柱内的移动速度快；从而造成了A、B在柱内的差速迁移，即移动速度不同。  当经过一段距离后，速度的差异造成A、B组分先后出柱，得到分离。这就是色谱过程的本质。  掌握的要点：  （1）组分在柱内随流动相不断移动（溶解于流动相）。  （2）固定相与组分有亲合能力，即对组分有滞留能力（保留能力），使组分的速度低于流动相速度。  （3）性质不同的组分与固定相亲合力不同，固定相对其滞留能力（保留能力）不同，造成迁移速度不同（差速迁移）。  （4）经过一定柱长后，各组分因速度差异而分开，即需要一定的柱长。 二、色谱流出曲线（色谱图）

 所谓色谱流出曲线，即流出液中的组分浓度随洗脱体积或洗脱时间的变化曲线，也称色谱图。  获得：  （1）间隔一定时间或一定流出体积，测定流出液中组分的浓度，以浓度为纵坐标，时间或体积为横坐标，描点作图即得  （2）在柱子出口处设置检测器，如测定流出液的吸光度，换算成浓度（信号值），连续记录流出液的吸光度随时间的变化，即得色谱图（仪器化）。  流出曲线是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性、定量的依据。  色谱流出曲线的意义：  色谱峰数=样品中单组分的最少个数；  色谱保留值——定性依据；  色谱峰高或面积——定量依据；  色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；  色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。 三、几个重要的色谱参数及概念  （1）基线：在实验条件下，当只有流动相通过（检测器）色谱柱时，得到的流出曲线，通常为一水平直线称为基线。  （2）峰高（h）：从色谱峰到基线的垂直距离。  （3）峰宽（Wb）：从色谱峰的捌点作切线，与基线两交点之间的距离，也称基线宽度。  （4）半峰宽（W1/2）：色谱峰高一半处峰的宽度（不是峰宽的一半）  （5）标准偏差（σ）：色谱峰两侧两捌点之间的距离的一半，也即0.607h处的峰宽的一半。  Wｂ、σ、W1/2色谱意义： 它们反映被分离的组分分子在柱内迁移时的离散程度,Wｂ、σ、W1/2越小，表示分子相对集中； Wｂ、σ、W1/2 越大,表示分子相对分散。  （6）拖尾因子T: 0.95～1.05，色谱峰为对称峰  （7）保留时间(tR)（Retention time）  流动相携带组分通过柱子所需要的时间，即从进样洗脱到流出液中组分的浓度出现极大值点所需要的时间。  （8）死时间(t0)  不被固定相所滞留的组分通过色谱柱所用的时间，即不被固定相所滞留的组分的保留时间，即死时间。  在时间上，它等于流动相分子通过色谱柱所需的时间，当某组分不被固定相所滞留时，即完全随流动相移动，其移动速度完全等于流动相的速度，所以t0=tm。  （9）调整保留时间(tR’)：扣除死时间后的组分实际被固定相所保留的时间,即tR’= tR-t0 = tR-tm  意义：  组分随流动相移动的时间都是相同的，都是死时间。它与固定相、组分的性质均无关，只与流动相的流动速度有关，对分离不起作用。  tR’即为组分在固定相中出现的（保留的）时间，即组分被固定相所滞留的时间，与组分和固定相之间的作用力有关。  tR’是与组分和固定相性质有关的，更能从本质上反映出不同组分的差异，反映色谱过程的实质。  （10）保留体积（VR）  从进样开始到组分洗脱出柱所用的洗脱剂的体积（与流速无关）。  （11）死体积（V0、Vm）  不被固定相滞留的组分的保留体积 (或不被固定相滞留的组分流出色谱柱所需要的洗脱剂的体积)。  这个体积应等于柱内流动相的体积，即流动相的量，也即固定相之间的空隙。  （12）调整保留体积（VR’）  VR’=VR - V0=VR - VM  （13）相对保留值（α2,1，γ2,1）  以一已知物的调整保留值为基准，其它各组分的调整保留值与之比值即为α2,1，γ2,1。

 α2,1=tR 2’/tR 1’=VR 2’/VR 1’=γ2,1  须注意：  ① 规定对于α2,1须有tR 2’>tR1’ VR 2’>VR 1’ 即α2,1>1。  ② 对于γ2,1, “1”表示基准物质, “2”表示待测物质,用于定性分析。  ③ 相对保留值只与固定相、组分及流动相的性质有关,与柱长、流速等无关。  ④ 若两组分能分离,则α2,1>1  ⑤ α2,1又称为选择性因子  （14）柱长(L)：柱中填充固定相部分的长度。  要点：  ① 需掌握tR、VR、t0 (tm)、tR’、VR’的色谱学意义及定义。  ② 这些参数之间的关系，它们能说明什么问题?

色谱法基本原理 p218  色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。  但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。  因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。 一、色谱法分离过程的动力学观点  所谓动力学观点是以分子的运动速度来考虑问题，研究的是状态随时间的变化率。 1、组分在色谱柱内的移动速度（绝对速度）  被分离的组分以一定的速度随流动相迁移。当考虑一个分子时，它的迁移速度受两个因素影响：  （1）被固定相滞留在固定相表面，分子停止前进，这时速度u组分=0。  （2）溶解于流动相中，随流动相同速前进，这时u组分=um。  所以组分分子在柱内的移动速度总是≤流动相在柱内的速度，即um 是极限速度。  组分移动速度的大小，决定于固定相对组分的保留能力，即固定相与组分间作用力的大小。  不同的组分，固定相对它的保留能力不同，其移动速度不同。  设组分的移动速度为u组分（u组分=L/tR）， 即绝对速度，此速度受到流动相流速的影响，人们将两个组分的速度都与流动相相比较，就得保留速度  2、保留因子（保留比，retention factor、相对速度） 用R’表示，即：

R’= u组分/ um ≤1  不同的组分的迁移速度不同，R’不同，即固定相的保留能力不同（也称滞留因子）； R’越小，则固定相对组分的保留能力越强。  将保留因子用色谱参数表示：

R’ = u组分 / um = ( L / tR ) / ( L / tm ) = tm / tR = tm /（tm+tR’）  意义： 组分在色谱柱内有tm时间随流动相移动（u组分=um），有tR’时间停在固定相上（u组分=0），所以在色谱柱内的时间为tR’+tm=tR 。

 由此可见，组分在色谱柱内的移动速度取决于tR’，它直接反映出固定相对组分的保留能力，tR’不同，则u组分不同，即差速迁移，产生分离。