石油脱硫微生物的筛选及特性研究

石油脱硫微生物的筛选及特性研究 摘要 从泰安某加油站采集土壤样品，筛选到一株可以专一性降解二苯并噻吩（DBT）的菌株，经常规和生理生化鉴定判断为红球菌属（Rhodococcus sp.），命名为YY-5。对DBT的降解产物经分析为二羟基联苯（2-HBP）、二苯并噻砜（DBTO2）和硫酸根离子，完全符合“4S”途径。产物用gibb’s试剂结合分光光度计测试，测算出菌株的脱硫能力。脱硫试验表明，DBT浓度对菌株的脱硫能力也有影响，DBT浓度过高，会抑制菌株的脱硫能力。一般在54 h左右YY-5的酶活性开始降低，在80 h左右完成脱硫。在以正十二烷、正十六烷、液体石蜡、萘和柴油为碳源的培养基中生长不旺盛，不能利用上述烃类作唯一碳源和能源。说明YY-5在脱硫过程中不会明显降低燃油的燃烧值。另外试验也表明，有机氮对菌的脱硫活性有抑制作用。

关键词 二苯并噻吩；微生物脱硫；筛选；红球菌属；脱硫率 硫是地球上广泛分布的元素之一，约占地壳总质量的0.052%。硫基本以化合物的形式存在于各种矿物和化石燃料之中，少量为单质形式的硫磺。化石燃料含硫量为0.1%～6.0%。

目前世界环境问题严重，各国都在着手研究环境问题的解决方案。其中矿物燃料燃烧生成硫化物，在大气中形成酸雨，污染土壤的同时，也破坏了陆地生物圈的生态平衡。酸雨作为硫污染之一，对北欧地区的污染最为严重，导致湖泊中鱼类和浮游生物死亡，土壤表土营养物质淋溶，生态受到严重损坏。2013年初因为中国汽油、柴油质量不合格，汽车尾气排放污染空气，导致北京，成都等交通拥挤的城市形成经久不散的大雾，不仅市民的生活出行受到影响，对身体健康也有一定损害。此外，在石油的炼制过程中，输送管线及相关设备都会受到原油或馏分油中硫的腐蚀[1]。加氢脱硫（hydrodesulfurization HDS）法是目前常用的化学脱硫法，其原理是通过催化过程将有机硫化物转化成H2S气体，该法的缺点在于反应要求高（高温高压）、脱除不彻底、成本高，且难以达到现在严格的污染排放标准。

石油生物催化脱硫是利用微生物产生特定的酶选择性地将油品中含硫化合物转化为水溶性硫化物，具有高度的选择性，可以脱除HDS技术难脱除的残余有机含硫化合物。而且不需催化剂，不会产生额外污染。低能耗，硫的回收率高。目前生物脱硫研究技术的机理主要是以二苯并噻吩（DBT，针状结晶，熔点99 ℃，沸点332～333 ℃，联苯及苯硫醚结构）为模型化合物来表征的，在微生物酶的作用下脱硫。

生物催化DBT杂环类烃脱硫有2种氧化形式：c-c键断裂氧化和c-s键断裂氧化。20世纪70年代初，Kodama etc研究生物石油脱硫提出DBT生物降解的“Kodama”代谢途径，虽然可从烃中分离含硫化合物，但有机硫没有从杂环类化合物中脱除，反而降低了有价值烃的燃烧值。1989年Kilane在研究IGTS 细菌脱除煤中有机硫时，从理论上提出了生物降解DBT的一种可能的“4S”代谢途径： 二苯并噻吩中的硫经过4步氧化，反应的硫中间体分别是DBT-亚砜，DBT-砜，DBT-羟基磺酸，最终生成2-羟基联苯（2-HBP）。硫是以SO2-的形式从有机物中除去的，对烃不发生降解。对不同的菌株，4S途径并不完全相同，被认为有2种脱硫途径，但共同的特点都是对C-S键作用[2]。目前已经有大量国内外学者投入研究[3-5]。据报道，采用BDS可使油品硫含量最终指标低于HDS工艺10倍，如从HDS的0.1%降至BDS的0.01%的硫含量。目前适合研究石油脱硫的菌株有：玫瑰红球菌（Rhodococcus rhodochrous）、红串平红球菌（rhodococcus.erythropolis）、球形诺卡氏菌（nocardia globelula）、嗜热芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）、谷氨酸棒杆菌（corynebacterium sp.）、戈登氏菌（gordona sp.）、节杆菌（Arthrobacter sp.）、球形芽孢杆菌（B.sphaericus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。该文对加油站附近土壤中的脱硫微生物进行筛选，并对其特性进行研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验仪器。紫外分光光度计、生物培养箱（LRH2252G）、微生物多用培养箱（WDP）、超净工作台、无菌条件下G5漏斗真空抽滤。

1.1.2 试验样品及培养基。样品为采自泰安某加油站土壤20份。富集培养基：NH4Cl（0.1 g/L），MgCl2（0.48 g/L），KH2PO4（0.32 g/L），CaCl2·2H2O（0.08 g/L），甘油（5 g/L），去离子水1 000 mL，pH值7.0～7.2；灭菌后加无菌噻吩5 mL。

分离培养基（g/ L）：营养肉汁培养基。 摇瓶基本培养基：甘油（10 g/L），NH4Cl（5.0 g/L），KH2 PO4（6.3 g/L），K2HPO4（810 g/L），MgCl2·6H2O（12 g/L），微量元素液1 mL，维生素液1 mL，去离子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，无菌噻吩5 mL/L培养基（灭菌后分别加入），DBT2正十六烷液，500 mg/L DBT培养基（灭菌后分别加入）。微量元素液：FeCl3·4H2O（0.5 g/L），ZnCl2（0.5 g/L），MnCl2·4H2O（0.5 g/L），NaMoO4·2H2O（0.1 g/L），CuCl2（0.05 g/L），CoCl2（0.02 g/L），HCl调节pH值至2～3。

维生素液：泛酸钙（400 mg/L），肌醇（200 mg/L），烟酸（400 mg/L），盐酸吡多辛（400 mg/L），复合维生素B（15 mg/L），去离子水1 000 mL[6]。1.2 试验方法

1.2.1 脱硫菌的富集和分离。从泰安炼油厂等地采集的土壤污染样品，置于DBT选择培养基中（DBT浓度0.15 mmol/L），在恒温27 ℃条件下，100 r/min振荡富集培养3 d。取培养物上清液在相同条件下继续培养3 d。取培养物高速离心10 min，取上清液做gibb’s分析。取反应呈阳性的培养物接种于选择培养基，27 ℃静置培养3 d。取生长状态好的单菌落培养物做gibb’s分析，有蓝色物质生成的即为目的菌株。 1.2.2 脱硫菌株的鉴定。①形态特征：有弯杆状和杆状2种形态，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，生长中等，黄油状黄色，菌落平坦，不透明，凸起，有光泽，不产生水溶性色素，边缘整齐。在营养肉汤培养基中形成表面膜，培养液则保持澄清。②生理生化特征：按照《常用细菌系统鉴定手册》[7]进行鉴定。

1.2.3 16S rDNA序列分析。以菌株基因组DNA 为模板，用16S rDNA通用引物扩增得到近全长的16S rDNA.PCR产物测序后在National Center for Biotechnology Information（NCBI）使用Clustal W Version 118和PHYL IPpackage programme 进行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较。

1.2.4 脱硫试验。准备5个250 mL三角瓶，每个加入50 mL DBT浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的基础培养基，室温27 ℃，180 r/min振荡培养。对照为不加DBT的YY-5菌株培养基，1 d后用正己烷萃取剩余的DBT。4 ℃，8 000 r/min离心20 min，用气相色谱分析DBT百分比。

1.2.5 菌株的脱硫特性研究。将培养液预处理后，用等体积二氯甲烷萃取，30 min后8 000 r/min离心。在萃取液中加入无水硫酸钠脱水并干燥。用K-D浓缩器吹高纯氮浓缩，50 ℃水浴，GC-MS分析。①DBT浓度对菌株YY-5脱硫率的影响。DBT脱硫试验步骤：取50 mL基础培养基5个，加入DBT使浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，室温27 ℃。200 r/min振荡培养。菌株YY-5的专一酶将DBT脱硫后，经“4S”途径的代谢终产物为2-HBP，与gibb’s试剂反应生成蓝色靛酚衍生物，该衍生物在610 nm存在最大吸收峰。菌体离心后，取上清液与gibb’s试剂反应，再用722-E分光光度计测定OD610，通过吸光度值与2-HBP的浓度的标准曲线算出培养液中2-HBP的浓度，以测算菌株的脱硫能力。②碳、氮源对菌株生长脱硫的影响。一是菌株生长曲线的测定：取该菌株培养物测出其最大吸光度。取生长3 d后的菌株分别接种在10个三角瓶中，室温摇床培养。每隔5 h取一瓶稀释10倍。测定最大吸光波长的吸光度。画出生长曲线，时间为横坐标，吸光度为纵坐标。二是在50 mL基本培养基中，分别加入1%的正十二烷、正十六烷、液体石蜡、萘、柴油、甘油、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、醋酸钠为碳源，接种量2 mL，室温27 ℃，120 r/min摇床培养3 d后，取样分析。三是在摇瓶基本培养基中，分别加入牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵和磷酸二氢铵作氮源，接种量2 mL，30 ℃，120 r/min摇床培养48 h。

2 结果与分析 2.1 生理生化特征 对菌株YY-5进行生理生化鉴定，革兰氏染色阳性，水解淀粉酶阳性，氧化酶阴性，葡萄糖阳性，亮氨酸阳性，甘露糖阳性，麦芽糖阳性，谷氨酸阳性，乙醇阳性。

2.2 16S rDNA鉴定