转座子插入敲除
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
基因敲除技术
基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。
这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。
通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。
基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。
常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。
CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。
它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。
Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。
CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。
在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。
转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。
转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。
转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。
在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。
在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。
【分享】基因敲除细胞株构建流程
【分享】基因敲除细胞株构建流程如果选择的方法不对，或者细胞株不对，不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢？筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节！如果没有正确的方法那么基因敲除的细胞株工作就不能顺利的进行，首先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么？其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤，让自己轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。
一. 如何选择基因敲除的细胞：1.关键点：支原体污染在绝大部分的实验室里都不太被重视，如果支原体污染了细胞，则会导致细胞产生很多问题：如细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，产生的数据也会有很大的误差，所以在实验室里的技术人员都需要非常重视。
2.检测方法有两种：细胞培养和PCR鉴定。
3.基因敲除的优势：克隆形成率高，敲除效率高，细胞容易增殖，但是有一个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建，也无法获得基因敲除的单克隆细胞，那就是没有多基因的问题；染色体不突变；难增殖的细胞；细胞的数量有限；做基因敲除细胞株难以得到纯合子敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。
4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永生细胞系，往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
二. 基因敲除细胞系的敲除方法：1.建议首选：如果只是做常规的移码敲除，那么一个细胞里面只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是一样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择片段敲除是一个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，大片段的基因敲除是几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除方法：纯合敲除细胞系，比移码敲除效率更高。
3.如何判断是大片段敲除的细胞系：主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。
基因敲除技术及其进展
基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in MetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。
本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。
并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。
关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术 (1)1.1基因敲除相关背景 (1)1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)第二章基因敲除策略 (3)2.1传统的基因敲除策略 (3)2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)2.2新兴的基因敲除策略 (5)2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)第三章前景展望 (9)参考文献 (10)致谢 (11)第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。
如何在基因编辑中实现基因组片段的插入
如何在基因编辑中实现基因组片段的插入基因编辑是一种新兴的技术，可以对生物体的基因组进行精确的修改。
在基因编辑中，实现基因组片段的插入是一个重要的任务。
本文将介绍如何在基因编辑中实现基因组片段的插入，并探讨该技术的应用前景。
基因组片段的插入是指将外源的DNA片段或基因序列精确地嵌入到目标生物体的基因组中。
这种插入可以用于多种目的，例如增加或改变特定基因的功能，研究基因的功能机制，以及治疗某些遗传疾病等。
目前主要有三种方法可以实现基因组片段的插入：使用转座子系统、利用CRISPR-Cas9系统和基因修复机制。
转座子系统是一种天然存在于多种生物体中的基因移动工具。
转座子是一段可以从一个位置移动到另一个位置的DNA序列。
通过将所需的基因组片段嵌入到转座子中，然后利用转座子的特性将其插入到目标基因组中，可以实现基因组片段的插入。
这种方法的优点是高效、稳定，适用于多种生物体。
然而，由于需要使用特定的转座子，该方法在一些生物体中的应用受到限制。
CRISPR-Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，具有高效、精确和方便的特点。
该系统利用一种细菌的天然防御机制，可以精确剪切基因组中的特定DNA序列。
通过设计特定的引导RNA，可以将CRISPR-Cas9系统引导到目标基因组中的特定位置，然后利用Cas9酶的切割功能，将外源的基因组片段插入到目标基因组中。
CRISPR-Cas9系统的优点是操作简单、效率高，可以用于多种生物体中的基因编辑。
然而，该系统也存在一些局限性，例如可能引发意外的剪切和插入事件，以及可能引发基因组不稳定性等问题。
基因修复机制是细胞为修复损伤的DNA而存在的一种机制。
在基因编辑中，可以利用细胞的基因修复机制实现基因组片段的插入。
通过设计特定的DNA片段，例如同源重组修复体，可以引导细胞利用同源基因修复机制将外源的基因组片段插入到目标基因组中。
这种方法的优点是不需要外源工具，而且可以在细胞中实现高效和准确的插入。
以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用
以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用武有聪;孟媛媛;丁百兴;韩海燕;瞿涤;白丽【摘要】葡萄球菌是医院内感染的重要病原菌,通过同源重组敲除葡萄球菌的靶基因是研究其功能的重要方法.以质粒为基础的重组系统是外源基因序列传递,发生同源重组的重要载体.近年来,葡萄球菌基因敲除所用的重组质粒的特性取得不断改进.结合本课题组工作,简要综述以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用及技巧,重点比较不同质粒的特点及使用条件,对于葡萄球菌致病机制研究具有借鉴意义.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2019(035)007【总页数】6页(P581-586)【关键词】质粒;同源重组;基因敲除;葡萄球菌【作者】武有聪;孟媛媛;丁百兴;韩海燕;瞿涤;白丽【作者单位】大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室,上海 200032;大理大学基础医学院病原生物学综合实验室,大理671000【正文语种】中文【中图分类】R382.5研究细菌基因功能的方法主要有基因敲除(基因组中直接去除某基因，位点特异)、反义RNA干扰(降低mRNA表达量，影响因素多)、转座子插入突变(插入位点随机，筛选繁琐，存在多位点插入突变)、基因过表达等技术，但最可靠而常用的方法仍是基因敲除[1-2]，即选择合适的质粒，将靶基因两侧的同源序列克隆至载体上，转入宿主菌后通过同源重组实现对靶基因的置换敲除。
由于微生物的多样性，将外源DNA导入宿主菌并完成同源重组的策略也千差万别。
目前，未见有适合于多种宿主菌基因敲除的通用重组系统的报道。
转座子插入敲除
特点：
• 1、所有生物的染色体都有转座子 • 2、转座相关序列可以占据物种基因的很大
一部分，如人和玉米基因组的50%以上是由 转座相关序列组成 • 3、转座子的含量在不同基因组中变化很大 • 4、当转座子移位时，转座因子通常对插入 位点几乎没有序列选择性
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转座子类型：
• 1、DNA转座子 • 2、类病毒反转录转座子 • 3、聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子
• 一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲 掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成 容易识别的表型，因为基因家族的其他成 员可以提供同样的功能；
• 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会 造成细胞的致死性，a也就无法对这些必需 13
•转座子(transposon)是存在于DNA上可自 主复制和移位的基本单位。 •由Barbara McClintock 在20世纪40年代首 次从玉米中发现，从此改变了人们对基因 组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在 染色体上呈线性固定排的传统理论。 •1983年McClintock因发现转座子被授予诺 贝尔奖
机插入突变，建立一个携带随机插入突变
的细胞库，然后通过相应的标记（如Tn5转
座子含kan抗性基因）进行筛选获得相应的
基因敲除细胞。
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• 睡美人转座子(sleeping bueaty,转座子SB)已证明在小鼠和人 细胞中可以激活,转座子插入新的位点后，该位点附近的基 因即受到抑制呈现隐性的“睡美人”表型。
• 一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走，该位点的 基因隐性表型又恢复为显性表型，即“睡美人苏醒”。调控 转座酶和转座子活性的系统称为青蛙王子(Frog Prince)。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
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• （3 ）当一个基因家族的多个成员沿染色体串连排列时，可采用复
制型的转座系统创建该基因家族全部成员均被敲除的突变体。
• 随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多 不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终 存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因 并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括： • 一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一 个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别 的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同 样的功能； • 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成 细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行 相应的研究了
特点：
• 1、所有生物的染色体都有转座子 • 2、转座相关序列可以占据物种基因的很大 一部分，如人和玉米基因组的50%以上是由 转座相关序列组成 • 3、转座子的含量在不同基因组中变化很大 • 4、当转座子移位时，转座因子通常对插入 位点几乎没有序列选择性
转座子类型：
• 1、DNA转座子
• 2、类病毒反转录转座子
• 睡美人转座子(sleeping bueaty,转座子SB)已证明在小鼠和人细胞中
可以激活,转座子插入新的位点后，该位点附近的基因即受到抑制
呈现隐性的“睡美人”表型。 • 一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走，该位点的基因 隐性表型又恢复为显性表型，即“睡美人苏醒”。调控转座酶和 转座子活性的系统称为青蛙王子(Frog Prince)。 • 用特异的开放阅读框捕获技术，可以使自然散在的转座酶编码基 因高表达，人为催化激活转座子使其苏醒，执行插入、切除等任
•转座子(transposon)是存在于DNA上可自 主复制和移位的基本单位。 •由Barbara McClintock 在20世纪40年代首 次从玉米中发现，从此改变了人们对基因 组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在 染色体上呈线性固定排的传统理论。 •1983年McClintock因发现转座子被授予诺 贝尔奖
务。目前已经应用于微生物、昆虫、植物、动物及人类基因组功
能的研究。例如蛙类基因组含有Tcl水手转座子超家族，呈自然失 激活转座子，使睡美人转座子苏醒。
活状态，转座酶与转座增强子序列末端结合,在HMGBI蛋白协助下，
使用转座子进行插入突变的优点有：
• （1 ）转座子能够在转座酶的存在下从插入位点剪切下来，造成突
变体反转。采用这种方法可进一步确证突变体表型是否由转座子 插入突变引起。 • （2）大多数转座的位点偏好于连锁位点，所以如果有一个可转座 的元件靠近目的基因，那么可转座的元件即会高效地移动并插入 目的基因。因此，即使在突变体库中没有发现期望的插入位点， 仍可以采用转座子在连锁位点上的转座获得目的基因被插入失活 的品系。
• 3、聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子
转座机制：
• 1、剪切-粘贴机制
ห้องสมุดไป่ตู้
• 2、复制-粘贴机制
插入突变
• 转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移 动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因内部 或邻近位点时时，就会引起该基因的失活，并 诱导产生突变型。
• 因此我们可以利用某些能随机插入基因序列的 转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突 变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然 后通过相应的标记（如Tn5转座子含kan抗性基 因）进行筛选获得相应的基因敲除细胞。