噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

综述・讲座噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用薛国柱,　吕勇刚,　窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安710032Selection technology of phage antibody library and its application in tumor re searchX U E Guo2z hu,L U・・Yong2gang,DOU Ke2f engDepartment of Hepato2biliary S urgery,Xi jing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi’an710032,P.R.China【摘要】　噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或scFv,这些分子的群体称为抗体库。

经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。

经典的筛选方法为固相或液相抗原识别,前提条件是能得到抗原纯品,对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用,所以又出现全细胞筛选,直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选,无需纯抗原,但目标抗原一定要有较高的表达水平,对于表达较低的情况,一种策略是先利用正常细胞筛选,去掉无关抗原后,再利用肿瘤细胞筛选;另一种策略是细胞内化筛选,特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞,获得特异性抗体。

其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等,适用面较窄,未获推广。

筛选效率主要通过以下几项的检测:转化数,即被感染的噬菌体数,它随筛选轮数的增加而增加;抗体基因插入载体的频率,高比例的丢失意味着筛选的低效率;抗体亲和性。

抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点,如细胞融合、动物免疫等,目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用。

肿瘤防治杂志,2005,12(23):1829-1832[ABSTRACT]　Phage antibody means those Fab or scFv, which display in the membrane of phages.The repertoires of these antibodies are antibody library.Biopinned by antigen or cell,relevant antibody can be got.Classical biopanning tech2 nique is antigen(solidified or liquefied)recognition by purified antigen,when the purified antigen can not be obtained,the classical technique can not be applied.So f ull cell biopanning has appeared,which needs not purify antigen,but the target antigen must be highly expressed,otherwise,some strategy can be used.One is wiping off the irrespective antigen by nor2 mal cells,then tumor cell antigen is relatively high,another strategy is internalizing biopanning:special antibody is inter2 nalized by certain technique,then the irrelative antibody is washed off,special antibody is got by splitting the cells.Oth2 er techniques such as in tissue sections selection and in vivo selection were narrowly applied.The biopanning efficiency is detected by following aspects:transforming unit,enhanced with the round of biopanning;the f requency of gene f using, high deletion of antibody gene meaning low efficiency;the af2 finity of antibody.The antibody library technique can avoid many problems of hybridoma such as cell f usion and animal immunity.It has been used in tumor diagnosis and treatment.Chin J Cancer Prev T reat,2005,12(23):1829-1832【关键词】　肿瘤/免疫学;噬菌体/免疫学;抗体,细菌;综述文献[KE YWOR DS]　neoplasms/immunology;bacteriophages/immunology;antibodies,bacterial;review literature 【中图分类号】　R730.3 【文献标识码】　A 【文章编号】　1009-4571(2005)23-1829-04 噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fas或单链抗体ScFv。

用基因克隆技术将B细胞全【第一作者简介】　薛国柱,男,河南新野人,博士,副主任医师,主要从事肿瘤抗体研究工作。

Tel:86-29-83375259　E2mail:xgzhu2003@ 【通讯作者简介】　窦科峰,男,陕西乾县人,博士,教授,博士生导师,主任医师,主要从事肝癌、肝移植的研究工作。

Tel:86-29-83375259　E2mail:gdwk@f 套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库[1]。

经特定抗原或细胞筛选后获得该特异性抗体。

该技术可绕过免疫制备全人源性抗体,避免了鼠源性抗体在人体应用时诱发HAMA等不良反应,成为继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代基因工程抗体技术,在生物科学,尤其是肿瘤研究领域极具潜力[2,3]。

1　噬菌体抗体库的筛选方法噬菌体抗体的特点是它既可以识别相应抗原与其相结合,又能够感染宿主菌进行再扩增。

利用这一特性,利用靶抗原亲和2吸附2洗脱2扩增,可筛选到靶分子的配体肽链[4]。

可经突变和链置换方法改进抗体亲和力,最终获得高亲和力的特异性抗体。

要获得高亲和力的噬菌体抗体,抗体库的筛选是关键环节和步骤[1,5]。

抗体库的筛选,需要优化许多条件,更重要的是优化筛选策略。

噬菌体抗体库的筛选包括2个主要步骤:淘筛和鉴定[5,6]。

淘筛(panning)是指噬菌体抗体库与选择的抗原共同孵育,通过几轮洗脱中断噬菌体2抗原反应,而同时不影响噬菌体的感染能力,弃去未结合的噬菌体,收集结合的噬菌体。

获得的噬菌体感染细菌并扩增,进行下一轮淘筛。

几轮淘筛后富集到抗原特异性结合的噬菌体多克隆。

筛选过程包括将从噬菌体多克隆中挑选出单克隆抗体;淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板,挑选单克隆。

至此可得到高特异性单克隆菌株,并可继续分离出抗体基因,可进一步分析、鉴定和工程化生产[5]。

1.1　固相或液相纯化抗原的筛选用纯化或重组的抗原从噬菌体抗体库中筛选噬菌体抗体的传统方法主要有:1)将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。

2)将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链亲和素(st reptavidin)的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。

生物素化的抗原与磁珠结合,再通过磁场将结合抗原的噬菌体与未结合的噬菌体分开。

当筛选大库容量的抗体库时,液相筛选会更好些,因为它可以增加抗原与结合噬菌体接触的机会。

回收的噬菌体感染宿主菌,增殖后进行下一轮筛选[7]。

为提高筛选效率,对传统的用包被在固体表面的抗原进行筛选的方法进行了不断改进,如将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染系统[8]。

传统的筛选系统中基因重组噬菌体仍有野生型的pⅢ蛋白存在。

因此,重组噬菌体具有感染能力,这导致了在筛选后的扩增时,特异性和非特异性的噬菌体均可进入宿主菌增殖。

选择性感染噬菌体(se2 lectively2infection p hage,SIP)筛选系统把筛选和扩增合并为一步,只有特异性噬菌体才能感染宿主菌扩增。

这样不仅简化了筛选步骤,而且大幅度地提高了筛选效率。

噬菌体感染 E.coli细胞是通过F pilus(伞毛)介导,噬菌体外壳pⅢ蛋白N端参与噬菌体穿过细胞膜和同F pilus的结合。

SIP筛选的基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代使配基的结合恢复感染能力,只有特异性噬菌体可以通过配基的结合恢复感染能力,进入宿主细胞增殖。

这一系统也显示了较高的筛选效率。

1.2　全细胞筛选目前,文献报道的特异性噬菌体抗体多数是由固相纯化抗原筛选得到的[4]。

经典筛选技术的前提条件是目标抗体所针对抗原的性质明确,能得到抗原纯品。

对于抗原无法提纯、抗原性质不确定(如癌细胞表面受体),或传统筛选会使抗原失活(如某些膜的内在蛋白)的情况,传统筛选技术不再适用,建立新的筛选系统成为研究的另一个重点。

为了提高筛选效率,许多研究者对传统的筛选技术进行了改进[9,10]。

为了分离得到肿瘤特异性抗体,必须在肿瘤抗原上进行筛选。

最近,直接用细胞系从单链噬菌体抗体库筛选细胞表面受体结合抗体已有报道[10]。

人们通过改进筛选策略,用肿瘤作为靶抗原已从噬菌体抗体库中筛选出许多肿瘤特异性抗体,如Kup sch等[11]筛选出了与黑色素瘤细胞特异性结合的抗体。

用全细胞来筛选抗体库,目标抗原一定要有较高的表达水平,一般在筛选前有必要先与不表达该抗原的细胞进行孵育。

Ridgway等[12]就是采用这一方法先用正常的支气管上皮细胞系将非特异的噬菌体抗体预先清除后,再用肺腺癌细胞系成功地筛选到了抗CD55的单链抗体。

但其筛选效率仍较低,且容易丢失亲和性噬菌体。

因此,有的学者把少量抗原阳性的细胞与大量抗原阴性的细胞混合,其中抗原阴性的细胞可吸附非特异性的噬菌体,而特异性的噬菌体可竞争性地与抗原阳性细胞结合,再用荧光激活细胞分类法(fluorecence2activated cell sorter,FACS)将结合有特异性抗体的抗原阳性细胞分离。