生物化工论文

固定化酶的发展和应用

内容摘要：固定化酶在现代的工业生产中扮演着举足轻重的作用，从固定化酶的发展过程着手，介绍传统方法和新方法的研究方向，以及在生活和生产方面的应用。

关键词：固定化酶，传统方法，应用

所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶, 能连续地进行反应, 反应后的酶，可以重复回收使用。固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出, 在这种情况下, 酶本身仍是可溶的。因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称。

一、固定化酶有以下优点:

1.反应完成后经过滤或离心等简单的方法就可回收，重复使用，降低了酶制剂的成本；

2.可以装成酶柱,当底物溶液流经酶柱时，就能发生酶促反应,适合于工业化应用；

3.酶经过固定化后,稳定性一般都有所提高。用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展, 也可采用含酶细胞或细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应。由于微生物细胞可直接作为酶源,所以逐渐产生了固定化细胞技术。

二、固定化酶的传统方法

1.吸附固定化

吸附固定化是指用物理方法将载体和酶以非共价键的方式结合起来，在过去的几十年中应用的比较广泛，也是最早采用的固定化方之一。吸附的方法主要有①静电作用吸附；②疏水吸附；③亲和吸附；④生物的特异性和非特异性吸附等。特异性吸附赖配基的结合，致使与结合载体结合紧密，其中氧化皓作为基质载体，其表面有不同的亲和基团，在和伴刀豆球蛋白A结合时，利用的是特异性固定化酶的吸附方面的技术。二氧化硅、大孔共聚物、黏土、聚氯三氟乙烯（PCTFE）等利用疏水方式固定。而非空硅石固定青霉素酰氨基转移酶、M41S硅石固定脂

酶、微孔陶瓷固定β-葡萄糖苷酶等则是用亲水方式。常用的硅藻土、沸石、中孔硅介质等仅是利用生物非特异性（范德华力、氢键等）吸附。在浮石-金属（TiCl4）复合物利用配位作用固定α-淀粉酶时，可得到50.7%的初始活力，还有利用透明醋酸纤维素上吡喃糖环上的-OH与金属之间的配位作用来固定化酶。这些吸附方法一般都可逆，载体可以重复使用，而且固定操作较为简单，一般没有对酶结构进行强性修饰，因此在很高程度上保持了酶的活性，然而容易遭到溶液中的pH值、离子强度、扩散、空间构型、载体性质、底物浓度、亲水性等方面影响酶活性而且吸附量有限，一般有机载体吸附量为几十毫克蛋白/克吸附剂，无机载体一般吸附量<1mg蛋白/g吸附剂。

2.包埋方法

酶的包埋是指用某种载体将酶包裹在其中，主要是将催化的酶分散在流体介质中，再通过一定的手段（物理或者化学）装载到不溶的载体中，形成固定化酶。在20世纪60年代，BERNFELD P等发现了丙烯酰胺单体在N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和溶解酶共存的情况下并保持了酶活性，以后逐渐受到重视，现在形成了共价包埋、双包埋、包埋交联等。现在的包埋技术不仅包埋一种酶，而且可以同时包埋2种以上进行共发酵。包埋可以分为共价包埋和非共价包埋2种。在载体的处理方面方法较多，大多数的多聚物包埋，可以通过射线、光或者化学引导其包埋酶。另外一些凝胶包埋通常在低温条件下处理（如聚乙烯醇（PVA）、海藻酸盐-Ca2+等）。还有一些亲水或疏水性酶被海藻酸盐、壳聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、p （HEMA）-水凝胶。一般还采用首先将酶包裹在载体颗粒中，然后用交联剂交联使得酶-载体结合紧密。包埋过程中载体的选择很重要，载体直接作用酶并影响着酶活性和吸附量，载体的尺寸、化学性质等。还有载体负载量、载体化学性质、扩散、酶被修饰后构造等。传统包埋主要分为单体聚合、化学交联包埋、物理包埋、共价包埋、凝胶包埋等。发展至今，出现了扩散包埋、渗透包埋、支撑包埋、修饰包埋等。

3.共价结合包埋

共价结合包埋基于化学反应，通过化学修饰的方法将载体上的活性官能团和酶表面上的氨基酸残基进行结合。共价结合就是酶、连接键、载体构成的一个集合体。这种方式构成的对酶本身的活性位点多数没有作用，但对酶的空间结构做

出不可逆的修饰，使得酶的活力、稳定性、选择性都有较大提升，而且在与载体结合的程度上也比较紧密，因此酶的丢失也相对减少。在共价结合酶的同时，有很多因素会影响酶的活性（如载体的物理性质，颗粒大小、形状、孔径等），孔径直接影响酶的吸附量，在多空玻璃固定木瓜蛋白酶的研究中，孔径是酶分子大小的3~9倍时才能有效地固定酶。在酶扩散限制方面，孔径最好是酶大小的8倍。载体的化学性质对载体进行性化学修饰，形成结合活性基团（CAG），这些基团与酶发生结合形成稳定的构象，而这种构型如果是原来酶构象相似的结构，那么酶活性将会不变甚至提高，这种构象的形成也受到外界微环境的影响，目前主要应用重氮法、叠氮法、烷基化反应法、硅烷化法、溴化氰法等对有机载体、高分子聚合物、人工合成高聚物等进行化学修饰形成CAG，一般进行修饰的载体具有聚酰叠氮、聚醛、聚酐、聚三嗪等。可以形成共价键的基团如游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、甲硫基、吲哚基、二硫键等。除了以上介绍的载体与酶形成的基团结合，另外还可以形成间隔臂，能影响载体与酶结合的性能。研究表明当酶和载体之间形成间隔臂结合的话，酶的流动性较以前有较大提高，耐碱性提高对高温也有很大抵御能力。一般现在用作间隔臂的物质最主要的有戊二醛、乙二醇二胺、聚乙烯亚胺、PEG二胺、乙醛葡聚糖，还有一些蛋白质。另外在酶方面，要使其与载体结合更加紧密，使其保持活性，那么也要对其进行适当的化学修饰，一般是对其结构中的非活性位点上的氨基酸进行修饰形成氨基酸残基，如精氨酸的呱基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基、蛋氨酸的二硫键等。这些残基的形成是通过不同的化学试剂作用而实现的，而目前并没有实现专一的化学药剂对其进行专一的修饰，一般目前多采用以下几种方式进行作用：二硫键、芳基化、烷基化、重氮、肽键形成、酰基化等共价结合法固定化酶，酶与载体结合较为紧密，一般吸附量大于载体本身，如甲基丙酸与苯聚合得到的聚合物其表面积只有8.6m2/g，但其表面可以固定10U/g的青霉素G酰化酶，另外活力提高很大，如固定在单宁酸纤维素上的氨基酰化酶固定热稳定性比固定在DEAE交联葡聚糖上的要高出40倍，活力也提高了5倍。但是手臂的增加使酶的稳定性下降，如蛋白酶利用手臂连接到聚丙烯醛上之后活性较没有用手臂的活性下降，目前并没有确切的机理来阐述原因。另外通过对酶的修饰，酶的构型发生了改变，从而使酶的选择性也发生改变，同时酶促反应过程中的副反应也被抑制，