9 154-156 转202 工艺技术 3+6 玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组DNA的研究
壳聚糖与DNA的作用及胺基对抑菌性能的影响
壳聚糖与DNA的作用及胺基对抑菌性能的影响李小芳1，2，冯小强1，杨声1*，苏中兴2*1 天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水（741001）2 兰州大学化学化工学院，甘肃兰州（730030）E-mail: zxsu@，ysh@摘要：采用抑菌圈法研究了壳聚糖对大肠杆菌(E .coli)和金黄色葡萄球菌(St. aureu s)的抑菌活性，并运用紫外吸收光谱和电化学的方法，研究了壳聚糖与DNA的相互作用,初步提出了壳聚糖对E. coli和St. aureu s的抑菌机理。
同时，利用壳聚糖的席夫碱反应，对壳聚糖的胺基进行保护后，研究了壳聚糖中的胺基对其抑菌性能的影响。
研究结果表明，壳聚糖对E. coli 和St. aureu s具有很好的抑制作用，且抑菌活性与其胺基有关；壳聚糖能与细胞内带负电的核酸结合，使细胞正常的DNA复制生理功能受到影响，抑制细菌的繁殖，从而达到抑菌的目的。
关键词：壳聚糖；抑菌活性；希夫碱；胺基；DNA中图分类号：Q9371. 引言Chitosan)是甲壳素脱乙酰化的产物,即脱乙酰基甲壳素,学名聚氨基葡萄糖,又名可溶性甲壳质、甲壳胺。
化学名称为(1，4)聚-2-氨基2-脱氧-β-D-葡聚糖,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过β-1, 4-糖苷键连接起来的来源丰富、无毒、可吸收降解的直链状高分子化合物.分子结构如下:壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌性能,它可抑制多种细菌和真菌等的生长[1-5]。
近年来，人们对壳聚糖的抑菌机理的认识已有了长远的发展。
但是，就其确切的抑菌机理目前尚不清楚，可以是众说纷纭.Young等认为壳聚糖可吸附于细菌表面,与细菌细胞膜作用而改变其通透性[6]；Helander等提出, 壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌作用是由于细胞外膜被破坏,最终造成菌体死亡[7]；Hadwiger提出以细菌分子中DNA为作用靶向的抗菌机理[8]；Tokura等认为壳聚糖吸附细菌后,壳聚糖分子包埋了整个细胞,抑制了细菌的呼吸和营养物质的进入而导致细菌死亡[9]；Papineu等研究认为壳聚糖的抑菌作用,可能是由于它导致了细胞内物质的泄漏而引起的[10]。
基因工程题库版
各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
葡萄球菌对克林霉素诱导型耐药的检测与分析
1.2仪器与试剂35℃恒温箱，ATB Expression细菌分析仪、ID32 STAPH细菌鉴定卡（生物梅里埃公司），红霉素药敏纸片（15μg）、克林霉素药敏纸片（2μg）（Oxoid公司），M-H琼脂（杭州天河）。
葡萄球菌对克林霉素诱导型耐药的检测与分析
了解我院临床分离的葡萄球菌对红霉素及克林霉素诱导型耐药的发生率，帮助临床医师正确选择MLSB药物。葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药呈明显上升趋势，且出现诱导型克林霉素耐药的菌株[1]。我们对临床分离到的葡萄球菌进行了红霉素、克林霉素耐药的检测，报告如下。
1材料和方法
参与文献
[1]刘欢乐，周铁丽.克林霉素诱导型耐药葡萄球菌的检测与分析[J].临床检验杂志，2005，23（5）：137-338.
[2]沈定霞，罗燕萍，徐雅萍，等.葡萄球菌对红霉素和克林霉素的诱导性耐药研究［J］.中华检验医学杂志，2005，28：400-402.
[3]Fiebelkorn K R, Cranford S A ,McElmeel M L,et al. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylcocci［J］.J Clin Microbiol,2003,41(10):4740-4744.
基因工程考试题库(便携版)资料
名词解释同裂酶（同切点酶）酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(噬菌体DNA等)，使得外源DNA细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA性内切酶的识别位点时，或当DNA因组DNA电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：DNA 样品的重新处理等。
7. 载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。
克隆载体：主要用于扩增或保存DNA有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BACYAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F高通量低拷贝的质粒载体。
表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、的载体。
病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，构建成的真核基因转移工具。
T-载体：Taq酶的末端转移酶活性可在PCR产物的3’依赖于模板的A，根据这一特性，为方便进行PCR而开发出T-载体。
final+edtion+完整版中科院历年细胞真题
中科院历年细胞真题中科院2001--A卷一.名词解释(2/20)1.受体2.细胞培养3.信号转导4.细胞学说5.应力纤维6.磷脂转换蛋白7.ES细胞8.嵌合体9.交叉10.Hayflick界限二.是非题(1/20)1.亚显微结构就是超微结构.( )2.光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者,所以能看到更小的细胞结构.( ）3.细胞外基质的作用是为细胞提供支持的框架.( )4.细胞与细胞间的粘连是由粘连蛋白介导的.粘连蛋白有的依赖Ca++,有的不依赖Ca++.( )5.粘连分子的受体是整合素.( )6.细胞间的通讯就是通过细胞间形成缝隙连接,是细胞质相互沟通而实现的.( )7.细胞分裂时内质网要经历解体与重建的过程.( )8.正常细胞发生癌变时游离的核糖体增多,而附着的核糖体和内质网的数目相应减少.( )9.a-肌动蛋白见于所有肌肉细胞和非肌肉细胞胞质中.( )10.从细胞内提取的分泌蛋白的分子量一般与分泌到细胞外的相应蛋白的分子量相同.( )11.真核基因的转录是从第一个ATG开始的.( )12.癌基因是有害的基因,因为它们的表达会导致肿瘤或癌.( )13.转录因子是一类具有RNA聚合酶活性的蛋白质.( )14.正常细胞在有丝分裂中期时,每条染色体的动粒均已分别结合来自纺锤体两极的微管.( )15.端粒酶以端粒DNA为模板夫指出更多的端粒重复单元,以保证染色体末端的稳定性.( )16.哺乳动物受精卵在发生卵裂到16细胞前,所有细胞都是全能细胞.( )17.体内的多能干细胞是不会衰老的.( )18.分化程度高的细胞由于细胞分裂能力的下降,发生改变的可能小于分化程度低的细胞.( )19.细胞分化就是细胞内组织专一性基因或者奢侈基因选择性的表达的结果.( )20.单细胞生物不存在细胞分化的现象.( )三.选择题(1/20)1.原核细胞与真核细胞虽有许多不同,但都有:A核仁B核糖体C线粒体D内质网2.Wilson根据光学显微镜下所见,绘制的细胞模式图上能见到_______.A内质网B核糖体C吞饮泡D核仁3.要探知细胞内某一蛋白质的表达水平,可以通过_______实现.A.Southern blotB.Northern blotC.Western blotD.原位分子杂交4.细胞变形足运动的本质是_______.1A细胞膜迅速扩张是细胞局部伸长B胞内微管迅速解聚使细胞变形C胞内微丝迅速重组装使细胞变形D胞内中等纤维重聚合使细胞变形5.A TP合酶(F0-F1A TPase)是______氧化磷酸化复合物.A线粒体内膜上的B细菌胞质中的C叶绿体中的D细胞膜内侧的6.小肠上皮吸收葡萄糖以及各种氨基酸时,通过_______达到逆浓度梯度运输.A与Na+相伴运输B与K+相伴运输C与Ca++相伴运输D载体蛋白利用A TP能量7.溶酶体的H+浓度比细胞质中高______倍.A 5B 10C 50D 100以上8.膜蛋白高度糖基化的是__________.A内质网膜B质膜C高尔基体膜D溶酶体膜9.参与纤毛运动的蛋白质是________.A驱动蛋白B动力蛋白C tau蛋白D微管结合蛋白210.成分最复杂的中间纤维蛋白是_________.A角蛋白B波形纤维蛋白C结蛋白D胶质纤维酸性蛋白11.细胞通过限制点时,_______.A DNA开始复制B RNA开始转录C蛋白质开始合成D都不对12.裂殖酵母中的cdc2基因在芽殖酵母中的同源物是_______.A.cdc2B.cdc25C.cdc28D.cdc2013.用胸腺嘧啶核苷酸处理增殖中的细胞可使其阻滞在_______期.A.G1B.SC.G2D.M14.灯刷染色体主要存在于________.A鱼类卵母细胞B昆虫卵母细胞C哺乳类卵母细胞D两栖类卵母细胞15.内含子的剪接位点具有________的特征.A5' -GU, 3' -AG B 5' -AG, 3' -GU C 5' -GA, 3' -UG D 5' -UG, 3' -GA16.前病毒是_______.A RNA病毒B逆转录RNA病毒C整合到宿主DNA中的逆转录DNA D整合到宿主DNA中的DNA病毒17.下列那一种蛋白质或酶最不可能是癌基因________.A GTP酶B蛋白质磷酸激酶C蛋白质磷酸酶D转录因子18.一把不认为________是细胞分化中基因表达调控的一个普遍机制.A DNA重排B DNA甲基化C组织特异基因的表达D一些非特异基因表达被抑制19.分化程度高的细胞比分化程度低的细胞对于外界因子的反应能力_________.A一样B下降C上升D前三者都有可能20.受精卵能发育成一个完整的个体,这种能使后代细胞形成完整个体的潜能为______.A单能性B多能性C全能性D发育性四.问答题(40)1.为什么在生理状态下,细胞膜内外的离子及电荷是不均等分布的?此不均等分布为什么是必须的?2.高尔基体在形态结构上至少有互相联系的三部分组成,请简述各部分的主要功能.3.试为高等生物中广泛存在基因家族的现象就其生物学意义提供解释.4.细胞分化是被选定的不同特异基因表达的结果,请举例说明分化时特异基因的表达调控方式.中国科学院上海生化与细胞所2002年（B）一、是非题：20题，每题1分，共20分。
革兰氏染色的实验报告（共9篇）
革兰氏染色的实验报告(共9篇)革兰氏染色实验报告革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。
为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。
本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。
染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。
本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。
本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。
关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。
革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。
经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。
革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。
革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)与枯草杆菌(B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。
同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。
本实验还涉及到高倍油镜的使用。
肺炎链球菌体内诱导基因的筛选及初步鉴定
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（&’’E） （V） VE #.MR _3=5H7-35H -6 "! ( I 7#6" 8/#.09/0!0(/#& 剔除那些在体外也表达的 !"#$ 作为体外报告基因， 基因， 最终鉴定出肺炎链球菌只在宿主体内诱导表 达的基因。
肺炎链球菌 （ ()*+,)-%-%%./ ,0+.1-02"+ ，( < ,0 ） 是 上呼吸道感染和严重侵袭性感染 （脓毒症、 脑膜炎） 的最重要的病原体之一。目前全球每年死于 ( < ,0 感染的总人数大致与结核相仿， 高达 ’$$ 万至 &$$ 万人， 其 中 "$ 岁 以 上 患 者 的 病 死 率 可 以 达 到 #$P［*］。近年来全世界范围内 ( < ,0 耐药菌株的感 染发病率显著增加， 使得 ( < ,0 感染的治疗面临越 来越大的困难。而目前常用的 ( < ,0 #’ 价多糖荚膜 而且对两岁 疫苗只对某些型别 ( < ,0 的感染有效；
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#& ,’’U- 的基因组 *M6 酶切片段， 与 报告质粒 -./0!7 ("!) 按 ! L %’： 的比例连接， 转化 % ， 共获得约 W,’’’ 个转化子， 即为含 % ( &’ 基因 *+, ! 组 *M6 随机片段的质粒库 （ -./0片段插入方向和片段平均大小 （ !’’U-） ， % ( &’ 的基因组全长约入率： 随机挑取 !’ 个独 立克隆， 用 质 粒 -./0! 多 克 隆 位 点 两 侧 测 序 引 物 0%， 0& 进行 0"P 鉴定， -./0!7 ("!) 为对照。!’ 个克 隆中， 有两个克隆 0"P 产 物 与 对 照 在 同 一 泳 动 位 置， 表明没有随机片段插入， 其余 较好。将此质粒库转化 % ( &’ !%&’! ("!) ) 缺陷菌
第一章质粒DNA的分离,纯化和鉴定
第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
中山大学生命科学学院 2011级 生物技术学 期末复习概要
中山大学生命科学学院 2011 级 生物技术学 期末复习概要
DNA 的双脱氧末端终止测序法 DNA 大片段的测序战略
分段克隆 引物走读 测序
DNA 全自动序列分析系统 水平超薄凝胶电泳技术 多路测序战略 焦磷酸释放测序（454） 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 蛋白质生物功能检测法→根据表达产物的生物活性 放射免疫原检测法→类似于菌落原位杂交，使用抗体 蛋白凝胶电泳检测法→以非重组子作为对照，通过对比电泳图谱判断 DNA 测序 Sanger sequencing：利用 ddNTP 加入后，碱基互补配对延伸过程中掺入 ddNTP 不 能延伸而终止，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率能够分辨到 1bp 的差异从而测 出。 目前常用的快速测序技术原理 DNA 全自动测序： 水平超薄凝胶电泳： 多路测序： 454 测序： PCR 技术 材料：模板、引物（17-20bp）、DNA 聚合酶（Taq、Pfu）、缓冲体系（Mg2+、 K+、pH8.5、Tris.CL、BSA、DTT、ddH2O）、dNTP PCR 循环：加热解链→冷却退火→延伸 影响 PCR 的因素 模板纯度 引物：长度、CG 百分比、3’端碱基 DNA 聚合酶质量 反应条件控制 Reverse transcription(RT)-PCR 基本步骤：RNA 提取→纯化→电泳检测→定量→逆转录→RCR→检测 应用：cDNA 克隆、低丰度 mRNA 测定（基因工程原理 p111） 引物 Random primer：随机的六聚体核苷酸 Oligo(dT) primer：poly（A）的尾巴 Sequence-specific primer Real-time PCR 原理与应用 基本原理：每一轮 PCR 进行或者完成就有相应强度的荧光放出，这使得荧光强度 和 PCR 进行次数成正比，通过与标准曲线中的荧光强度比较可以得出样本中模板 上的目标 DNA 的拷贝数。不同的具体荧光标记的方法不同，比如 Taq-man 探针 法、SYBR-Green-I 染料法、分子信标（molecular-beacon）以及 LUX-Primers 等 常见类别及原理
第一章质粒DNA的分离,纯化和鉴定
第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
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现代食品科技Modern Food Science and Technology2010, Vol.26, No.2玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组DNA的研究
赵文怡，高强，谯娜娜，张健，刘发保（天津科技大学生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津 300457）摘要：作为革兰氏阳性细菌，葡萄球菌的细胞壁非常坚固，为提取其DNA造成很大困难。本实验比较了不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁的结果，确定了玻璃微珠法破除其细胞壁具有简单有效快速廉价等优点，提取得到的基因组可用于PCR实验，此方法扩展到人葡萄球菌和耳葡萄球菌能够达到同样的提取效果。关键词：葡萄球菌；基因组DNA；玻璃微珠；PCR文章篇号:1673-9078(2010)2-154-156
Extraction of Staphylococcal Genome DNA using Glass-beads Method
ZHAO Wen-yi, GAO Qiang, QIAO Na-na, ZHANG Jian, LIU Fa-bao（Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry Education; College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China）Abstract: The cell walls of Gram-positive Staphylococci are difficult to be broken in DNA extraction. In this paper, 3 different methods for extracting Staphylococcus aureus genome were compared. Results showed that the extraction protocol using glass beads was simple, quick and effective to break staphylococcal cell wall, and the extracted staphylococcal genome was eligible for PCR. This method was also suitable for breaking the cell walls of S.hominis and S.auricularis.Key words: Staphylococci; genome DNA; glass beads; PCR
154葡萄球菌属（Staphylococci）是一类革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状故得名。其中多数为条件致病菌，个别菌株为肉类食品发酵用菌。作为最常见的化脓性球菌，葡萄球菌也是医院交叉感染的重要来源。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，其特征为起病急骤，呕吐剧烈伴失去及虚脱,这种疾病称为葡萄球菌食物中毒（staphylococcal food poisoning）[1]。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性食品卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒病例的33%，加拿大则更多，占到45%。我国每年发生的此类中毒事件也较多，其中金黄色葡萄球菌耐药菌株（MRSA）高达90%以上[2]。为了解决这一问题，提取葡萄球菌基因组DNA是必要检测与处理手段之一。然而，由于葡萄球菌细胞壁坚厚，常规的蛋清溶菌酶对其没有明显的溶壁作用，而具有良好溶壁效果收稿日期：2009-10-09基金项目：天津市应用基础及前沿技术研究计划(08JCZDJC15100)作者简介：赵文怡（1983-），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学通讯作者：高强（1965-），男，教授，主要研究方向：工业与食品微生物的分子生物学的溶葡萄球菌素价格昂贵，难以普遍应用。本文通过实验对比，确定了利用玻璃微珠简单有效提取葡萄球菌基因组DNA的方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验菌株与培养基金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SA113和耳葡萄球菌(S.auricularis)由德国图宾根大学Friedrich Goetz教授赠送，人葡萄球菌(S.hominis) 为本实验室保藏菌种。LB培养液(g/L)：蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 10。1.1.2 主要试剂玻璃微珠：河北省永清县兴华玻璃微珠有限公司；溶葡萄球菌素(lysostaphin):德国Genmedics GmbH公司赠送；蛋清溶菌酶(lysozyme)、Taq DNA聚合酶、RNaseA、EDTA、SDS、1 kb DNA Ladder和DNA Marker Ⅲ：天根生化科技（北京）有限公司；NaCl、NaAc、CTAB、无水乙醇、酚/氯仿/异戊醇等均为国产分析纯，PCR扩增引物合成：北京三博远志生物有限责任公司。1.1.3 主要仪器 QL-901型漩涡振荡器和GKL-150型金属恒温浴：江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司；琼脂糖凝胶电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；凝胶成像分析系统：美国Bio-Rad公司；PCR合成仪：德国Eppendorf GmbH公司；TG16G型离心机：湖南凯达科学仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 葡萄球菌基因组提取将金黄色葡萄球菌SA113菌株接种于5 mL LB培养液中，37 ℃振荡培养过夜，次日取1.5 mL菌液以12000 r/min室温离心1 min收集菌体，并用如下三种方法破壁并提取基因组DNA[2]，再从中选择合适的方法提取人葡萄球菌和耳葡萄球菌的基因组DNA。方法1：溶菌酶法。菌体沉淀重悬于补加了20 mg/mL溶菌酶的100 μL溶液Ⅰ(50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0)，37 ℃水浴1.5 h后加入100 μL溶液Ⅱ(0.2 mM NaOH，1% SDS)，快速颠倒离心管，待混合物变得清亮粘稠后置冰上放置5 min，最后加入150 μL溶液Ⅲ (5 M KAc 60 mL，冰乙酸11.5 mL，28.5 mL)，温和振荡使溶液充分混匀，混合物变成絮状沉淀后置冰上30 min，再于8000 r/min室温离心10 min，取上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），8000 r/min室温离心10 min，取上层水相，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），8000 r/min室温离心10 min，取上层水相，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后-20 ℃冷冻1 h以上，12000 r/min室温离心10 min，弃上清，沉淀于-20 ℃保存备用[3,4]。方法2：溶葡萄球菌素法。菌体沉淀重悬于100 μL溶液Ⅰ，依据不同的葡萄球菌种类加入0.5 mg/mL溶葡萄球菌素10~20 μL，后续实验步骤同方法1。方法3：玻璃微珠法。菌体沉淀重悬于100 μL溶液Ⅰ，加入40 μL玻璃微珠，在漩涡振荡器上振荡2~5 min(每振荡1 min后冰浴10 s)后加入100 μL溶液Ⅱ，后续实验步骤同方法1。1.2.2 葡萄球菌基因组DNA提取物的电泳检测 将提取的葡萄球菌基因组DNA沉淀溶于50 μL的TE缓冲液(10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA、pH 8.0)中，取3 μL用于1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测基因组DNA的提取效果。1.2.3 PCR扩增验证根据KEGG公布的S.aureus的甲酸脱氢酶基因fdh的序列，设计一对引物（GF：5′-AAGGATCC ATGTCA AACGGTGCCG-3′，GB：5′-CGGAATTCAGTGAACA CATATGTGCG-3′）检测提取的S.aureus 113基因组DNA的模板质量，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，循环参数为94 ℃ 45 s，45 ℃ 45 s，70 ℃ 70 s，30个循环后72 ℃延伸10 min；PCR反应体积为25 L，上下游引物1 L，模板1 L，双蒸水9.5 L，Taq PCR MasterMix12.5 L。用量参照已知葡萄球菌的脂肪酶保守序列，设计一对兼并引物（Geh-F:5′-GT(A/T) GA (T/C) TATGGTGC(A/T/G)GC(A/C)C-3′，Geh-B：5′-T(G/C/T) AC(T/C) TGCCA(G/T/A)A(C/T)ACC(T/C)TT-3′）来检测人葡萄球菌和耳葡萄球菌的基因组DNA模版质量，PCR程序同上。取10 μL PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。2 结果与分析2.1 三种方法的提取结果比较三种提取方法所得基因组产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。由图1可知，用溶葡萄球菌素的方法提取葡萄球菌基因组的效果最好，但该酶制剂价格昂贵；玻璃微珠破壁法也可以取得比较好基因组DNA的效果，提取量足够用于实验研究；溶菌酶法的基因组DNA提取量在这三种方法中是最少的。
图1 三种方法所提取基因组的对比Fig.1 The comparison of genome DNA extracted from staphylococcal by different extraction methods注：泳道1为1 kb DNA Ladder；泳道2~4分别为方法1、2和3的基因组提取物，其中玻璃微珠法的震荡时间为3 min。2.2 玻璃微珠法震荡时间不同的结果对比玻璃微珠法是采用物理方法进行葡萄球菌细胞壁的破壁，图2是采用玻璃微珠法破壁的电泳图。由图2可见，3 min振荡已经能够提取到清晰条带，但是振荡时间为5 min时，提取的S.aureus基因组的效果最佳。
图2 用玻璃微珠法提取S.aureus基因组的震荡时间比较Fig.2 The effect of shaking time with glass beads on extracting S.aureus genome DNA注：泳道1为1 kb DNA Ladder；泳道2~5分别为震荡5、4、3、2 min后的基因组提取物2.3 PCR扩增结果