博士硕士研究生入学考试-细胞生物学-简答论述及参考答案

1.简述酵母双杂交系统原理及应用答：酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。

许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。

例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。

GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。

但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质。

2.miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA的区别和联系答：miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。

3.试述磷酸酰肌醇双信号通路的基本内容及功能答：在这一信号转导途径中,膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gp蛋白(一种G蛋白),然后由Gq蛋白激活磷酸脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLC), 将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为两个细胞内的第二信使：二酰甘油( diacylglycerol, DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。

IP3动员细胞内钙库释放Ca2+到细胞质中与钙调蛋白结合，随后参与一系列的反应；而DAG在Ca2+的协同下激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，然后通过蛋白激酶C引起级联反应，进行细胞的应答, 故此将该系统称为PKC系统,或称为IP3、DAG、Ca2+信号通路。

静息状态时，G蛋白的α亚基上结合的是GDP，所以没有活性，磷脂酶C也是处于非活性状态。

第二信使IP3/DAG还是以前体PIP2存在。

内质网上的Ca2+离子配体闸门通道是关闭的，蛋白激酶C也是以可溶的非活性状态存在于细胞质中。

4.简述细胞质基质的功能答：细胞质基质是除去能分辨的细胞器和颗粒以外的细胞质中胶态的基底物质。

由水、无机盐、脂质、糖类、氨基酸、核苷酸等组成。

现又称细胞溶胶。

其主要功能包括：1.活细胞进行新陈代谢的主要场所，其为新陈代谢的进行，提供所需要的物质，如酶；2.提供细胞器的稳定微环境；3.影响细胞的形状。

5.受体酪氨酸激酶通路的组成特点和功能答：受体酪氨酸激酶(RTKS)是细胞表面一大类重要受体家族，当配体与受体结合，导致受体二聚化，激活受体的酪氨酸蛋白激酶活性，随即引起一系列磷酸化级联反应，终至细胞生理和基因表达的改变。

RTK-Ras信号通路是这类受体所介导的重要信号通路。

其基本模式为：配体→RTK→接头蛋白→GEF→Ras→Raf (MAPKKK)→MAPKK→MAPK→进入细胞核→其他激酶或基因调控蛋白(转录因子)的磷酸化修饰，对基因表达产生多种效应。

RTKS信号通路主要参与控制细胞生长、分化过程。

RTK-Ras信号通路具有广泛的功能，包括调节细胞的增殖分化，促进细胞存活，以及细胞代谢的调节与校正。

6.什么是非组蛋白？其结构特点和结构模式非组蛋白是指细胞核中组蛋白以外的酸性蛋白质。

非组蛋白不仅包括以DNA作为底物的酶，也包括作用于组蛋白的一些酶, 如组蛋白甲基化酶。

此外还包括DNA结合蛋白、组蛋白结合蛋白和调节蛋白。

非组蛋白能识别特异的DNA序列，识别信息来源于DNA核苷酸序列本身。

根据它们与DNA结合的结构域不同，其结构模式包括：螺旋-转角-螺旋模式（HTH）、锌指模式、亮氨酸拉链模式（ZIP）、螺旋-环-螺旋模式（HLH）、HMG框模式。

7.细胞骨架特异性药物有哪些及应用细胞松弛素B：切断微丝，结合在微丝正极阻抑肌动蛋白聚合，破坏微丝网络结构，并阻止细胞运动。

鬼笔环肽：与微丝有强亲和作用，使肌动蛋白纤维稳定，防止微丝解聚。

秋水仙素：结合到未聚合的微管蛋白二聚体上，阻断微管蛋白组装成微管，可破坏纺锤体结构。

是细胞停留在分裂期，以加倍染色体。

紫杉醇：促进微管装配，并使已形成的微管稳定。

8.论述叶绿体结构及功能高等动物的叶绿体多呈凸透镜状或香蕉形，含量较多。

藻类植物通常只有一个巨大的叶绿体，其形态有带状、螺旋状、星状等。

由叶绿体膜、类囊体和基质三部分组成。

9.举3例说明细胞蛋白质相互作用的实验方法，说明实验原理及应用①免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。

它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。

首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白X结合。

将预处理过的protein G琼脂糖珠（Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与protein G结合。

通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用western blot（或SDS-PAGE）进行检测。

②荧光共振能量转移技术的原理是：处于激活状态的供体，可以将其本身的荧光传递到与之十分邻近（通常在10 nm 之内）的受体上。

因此，如果用遗传突变的绿色荧光蛋白（GFP）或是合成的荧光染料标记蛋白质，则可以通过荧光体之间的能量传递来确定两蛋白质的相互作用。

这种方法较之上述的方法有两个优点：（1）蛋白质之间的相互作用是发生在完整细胞里，比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。

（2）利用这种方法，可以观察到蛋白质在细胞内的定位。

③Pulldown技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如GSH或者镍）。

以下图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白。

将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。

接着开始进行洗脱。

如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白X），说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。

10.细胞质膜的主要功能①为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境②选择性的物质运输并伴随着能量的转移③细胞识别与信息传递④为多种酶类提供结合位点⑤介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接⑥参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构⑦某些膜蛋白的异常与疾病直接相关。

11.蛋白质分选的类型及途径蛋白质分选有两条途径：一条是在细胞质基质中完成多肽链的合成，然后转运至膜围绕的细胞器，如线粒体(或叶绿体)、过氧化物酶体、细胞核及细胞质基质的特定部位；一条是蛋白质在糙面内质网上合成，经高尔基体运至溶酶体、细胞膜或分泌到细胞外。

包括四种类型1、门控运输（gated transport）：如通过核孔复合体的运输。

2、跨膜运输：蛋白质通过跨膜通道进入目的地。

如细胞质中合成的蛋白质通过线粒体上的转位因子（translocator）进入线粒体。

3、膜泡运输（vesicular transport）：被运输的物质在内质网或高尔基体中加工成有被小泡，选择性地运输到靶细胞器。

4、细胞质基质中的蛋白质的转运。

12.溶酶体的功能①清除功能：消化无用的生物大分子、衰老细胞及细胞器，保持正常细胞的代谢与调控；②防御功能：识别并吞噬入侵的病毒或细菌，形成异噬溶酶体③正常的消化作用，为细胞提供营养④在分泌细胞中，溶酶体往往参与调解分泌过程⑤受精过程中，精子的顶体相当于特化的溶酶体，内含多种水解酶类⑥自噬死亡中的功能。

13.核小体结构要点①每个核小体单位包括200 bp左右的DNA链、一个组蛋白八聚体及一分子组蛋白H1。

②组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构。

③146 bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20 bpDNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。

④相邻核小体之间以连接DNA相连(典型长度60 bp)，不同物种变化值为0~80 bp。

⑤组蛋白与DNA的相互作用是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，核小体具有自组装的性质。

⑥核小体在DNA分子中的形成部位受诸多因素影响，核小体位置改变可影响基因表达。

14.核糖体中rRNA的作用rRNA与蛋白质结合形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，形成肽链（肽链在内质网、高尔基体作用下盘区折叠加工修饰成蛋白质，原核生物在细胞质内完成）的合成。

rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。

15.凋亡的生物学特征及检测方式细胞凋亡的生物学特征包括：细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，胞膜结构仍然完整，最终形成凋亡小体。

细胞凋亡的检测方法包括：细胞凋亡的形态学检测；磷脂酰丝氨酸外翻分析；线粒体膜势能（△ψmt）的检测；DNA片断化检测；TUNEL法检测（DNA断裂的原位末端标记）；Caspase-3活性的检测等。

16.什么是RT-PCR，影响RT-PCR效率的因素逆转录PCR(reverse transcription PCR)或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

影响RT-PCR效率的因素主要有温度循环参数、引物引物设计、DNA聚合酶、Mg2+17.DNA结合蛋白的结构模式蛋白质结合DNA的结构域主要有5类：螺旋-转角-螺旋模式（HTH）、锌指模式、亮氨酸拉链模式（ZIP）、螺旋-环-螺旋模式（HLH）、HMG框模式.18.分泌蛋白的在细胞内产生，修饰，分泌过程首先细胞核中DNA转录成为mRNA,mRNA经过核孔进入细胞质,被细胞质中的核糖体发现,进入核糖体进行翻译,经过原料氨基酸的合成为多肽,经过信号肽引导，核糖体附着在内质网上,核糖体合成的多肽进入内质网,被内质网上附着的大量的酶加工、剪切,内质网腔膨大、出芽形成具膜的小泡，包裹着蛋白质转移到高尔基体，把蛋白质输送到高尔基体腔内，做进一步的加工。