【生物学】第五章 发酵过程及控制

第一节 发酵方式
以上由细胞生长、基质消耗和产物生长的微分方程 构成的微分方程组，反映了分批发酵中细胞、基质和产 物浓度的变化情况。对各种不同的微生物分批发酵过程， 通过实验研究这三个参数的变化规律，建立适当的微分 方程组，就可以对分批发酵进行模拟，进而进行优化控 制，最终达到提高生产效率的目的。 分批发酵过程一般可粗分为四期：即适应期（也有 称停滞期或延滞期的）、对数（指数）生长期、生长稳 定期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、 对数期、减速期、静止期和死亡（衰亡）期，如图5-1 所示。
第一节 发酵方式
停滞期的长短，差别很大，短的几乎觉察不到，瞬 间即可完成，而长的要在接种后2～3天才开始生长。种 子一般应采用对数生长期且达到一定浓度的培养物，该 种子能耐受含高渗化合物和低CO2分压的培养基。工业生 产中从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，希望尽 量缩短适应期。 （2）加速期（Ⅱ） 加速期（Ⅱ）通常很短，大多 数细胞在此期的比生长速率在短时间内从最小升到最大 值。如这时菌已完全适应其环境，养分过量又无抑制剂 便进入恒定的对数或指数生长期(Ⅲ)。
图5-2 分批培养中基质初始浓度对菌生长的影响
第一节 发酵方式
（1）得率系数Y 在浓度较低的（A-B）范围内，静止 期的细胞浓度与初始基质浓度成正比，可用式(5-5)表示 X＝Y（So一St） (5-5) 式中 so——初始基质浓度，g/L; st——经培养时间t时基质浓度； Y——得率系数，g细胞/g基质 在A-B的区域，当生长停止时，st等于零。方程(5-5)可用 于预测用多少初始基质便能得到相应的菌量。 （2）比生长速率µ 在C-D的区域，菌量不随初始基质 浓度的增加而增加。这时菌体的进一步生长受到积累的有 害代谢物的限制。用Monod方程可描述比生长速率和残留的 限制性基质浓度之间的关系 µ＝µmax s／（Ks＋S） (5-6)
-1 -1
第一节 发酵方式
图5-3 分批发酵过程中的若干重要参数的变化
第一节 发酵方式
3.分批发酵的优缺点 分批发酵在工业生产上占有重要地位。分批培养的
优点是：周期短，培养基一次灭菌，一次投料，容易实
现无菌状态；操作简单，易于操作控制，产品质量稳定； 培养浓度较高，易于产品分离。但是分批培养的辅助时
前国内外的酵母生产行业大多采用这种操作方法。
第一节 发酵方式
目前补料-分批培养已在发酵工业上普遍用于氨基 酸、抗生素、维生素、酶制剂、单细胞蛋白、有机酸以 及有机溶剂等的生产过程。目前补料-分批发酵的类型 很多，就补料的方式而言，有连续补料、不连续补料和 多周期补料；每次补料又可分为快速补料、恒速补料、 指数速度补料和变速补料；按反应器中发酵液体积区分， 又有变体积和恒体积之分；从反应器数目分类又有单级 和多级之分；从补加的培养基成分来分，又可分为单一 组分补料和多组分补料。
第一节 发酵方式
（5）静止期（V） 静止期（V），因营养物质耗尽， 有害物质大量积累，细胞的浓度达到最大值，不再增加。 实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零， 即µ＝α ，式中α 为比死亡速率。由于此期菌体的次级代谢 十分活跃，许多次级代谢物在此期大量合成，菌的形态也 发生较大的变化，如菌已分化、染色变浅、形成空胞等。 当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进 入死亡期（VI）。
第一节 发酵方式
式中 µ——比生长速率，h ； µmax——最大比生长速率，h ； S——基质浓度，g/L; Ks——基质利用常数，相当于µ＝µmax /2时的基质浓 度，g/L，是菌对基质的亲和力的一种度量。 分批培养中后期基质浓度下降，代谢有害物积累，已 成为生长限制因素，产值下降。其快慢取决于菌体对限制 性基质的亲和力大小，Ks小，对µ的影响较小，当St接近0 时，µ急速下降；Ks大，µ随St的减小而缓慢下跌，当st接近 0时，µ才迅速下降到零，见图5-3。
第一节 发酵方式
三、补料（流加）分批发酵
1.补料-分批发酵理论基础 补料-分批发酵是指先将一定量的培养液装入反应器，
在适宜的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产
物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应 器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，克 服由于养分不足，导致发酵过早结束，到反应终止时取出 整个反应系。流加培养是介于分批培养过程与连续培养过 程之间的一种过渡培养方法。
第一节 发酵方式
流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度。 一方面，它可以避免某些营养成分的初始浓度过高而出现底物 抑制现象；另一方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程 中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加培养与分 批培养的明显不同。由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应 体积是变化的，这是它的一个重要特征。 根据不同情况，存在不同的流加方式。从控制角度可分为 无反馈抑制流加和有反馈抑制流加两种。无反馈抑制流加包括 定量流加和间断流加等。有反馈抑制流加，一般是连续或间断 地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标，来 调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。
第一节 发酵方式
如果当Xt＝Xmax时开始补料，其稀释速率D＜µmax，实际 上当基质一进入培养液中很快便被耗竭，故可得输入的基 质等于细胞消耗的基质。虽培养液中的总菌量XT随时间的 延长而增加，但细胞浓度Xt并未提高，因此µ＝D。这种情 况称为准稳态。随时间的延长，D将随体积的增加而减少， D可用下式表达 D＝F/（V0＋Ft） （5-9） 式中 V0——发酵液原来的体积L； -1 D——稀释速率L ； t——补料时间h； F——补料流速L/h； V——t时发酵液体积L， V= V0＋Ft.
第一节 发酵方式
分批培养过程中随着培养基中营养物质的不断减少，
微生物生长的环境条件也随之不断变化，不能使细胞自 始至终处于最优条件下。因此，微生物分批培养是一种 非稳态的培养方法。但是在培养基接种后只要维持一定 温度，对于好气培养过程则还需进行通气搅拌，在培养 过程中，培养液中的细胞浓度、基质浓度和产物浓度不 断变化，但有一定规律。分批发酵是一种准封闭式系统， 种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生 物反应器内。
第一 发酵方式
（3）指数生长期(Ⅲ) 在这一阶段，由于培养基营养 物质丰富，有毒代谢物少，细胞生长不受限制，所以细胞 浓度随培养时间呈指数增长，可用方程(5-1)表示，将其积 分，再取自然对数得式 lnXt＝1nXo＋µt (5-4) 式中 X。——菌的初始浓度； Xt——经过培养时间t的菌体浓度。 将菌体浓度的自然对数与时间（lnXt ~t） 作图可得一 直线，其斜率为µ，即比生长速率。比生长速率与微生物种 类、培养温度、pH、培养基成份及限制基质浓度等因素有 关。在对数生长期，细胞的生长不受限制，因此，在对数 生长期的比生长速率达最大，可用µmax表示。
（6）死亡期（VI） 在死亡期（VI），细胞开始死亡， 活细胞的浓度不断下降，这时α ＞μ ，生长呈负增长。工 业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周 期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于菌的初始浓 度X0。
第一节 发酵方式
2. 重要的生长参数 分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响如图5-2 所示:
第一节 发酵方式
一些微生物如产黄青霉、构巢曲霉、甲烷加单孢霉、 贝内克氏菌的典型µmax值分别为（0.12、0.36、0.53、4.24） -1 h 。对数生长期的长短主要取决于培养基，包括溶氧的可 利用性和有害代谢产物的积累。 （4）减速期（Ⅳ） 在指数生长期，随着细胞的大量 繁殖，培养基中养分的迅速减少，有害代谢物的逐渐积累， 细胞的比生长速率逐渐下降，即进入减速期（Ⅳ）。细胞 的生长不可能再无限制地继续，这时比生长速率成为养分、 代谢产物和时间的函数，常用Monod方程表示。当限制性基 质浓度很低时，增加该基质浓度能显著提高细胞的比生长 速率，否则就不明显。
第一节 发酵方式
二、分批发酵
1.分批发酵的理论基础 分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养 物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长 繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养 方法。该方法在发酵开始时，将微生物菌种接入已经灭菌 的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在 整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡 剂的添加和控制pH需加入的酸或碱外，整个培养系统与外 界没有其他物质的交换。分批培养将细胞和培养液一次性 装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形 成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。分批培养 的特点是操作简单，易于掌握，因而是最常见的操作方式。
间较多，设备生产能力低。在目前国内外绝大多数发酵
生产中，都是采用分批培养的方法。
第一节 发酵方式
若细胞本身为产物，可采用能支持最高生长量的培养 条件；以初级代谢物为产物的，可设法延长与产物关联的 对数生长期；对次级代谢物的生产，可缩短对数生长期， 延长生产（静止）期，或降低对数期的生长速率，从而使 次级代谢物更早形成。但分批发酵不适用于测定其过程动 力学，因使用复合培养基，不能简单地运用Monod方程来描 述生长，存在基质抑制问题，出现二次生长现象。对基质 浓度敏感的产物，或次级代谢物，如对基质浓度敏感的产 物，或次级代谢物，比如抗生素，用分批发酵不合适，因 其周期较短，一般在1～2天，产率较低。这主要是由于养 分的耗竭，无法维持下去。据此，发展了补料-分批发酵。
第一节 发酵方式
若只有料液的输入，没有输出，发酵液的体积在增加。 若分批培养中的细胞生长受一种基质浓度的限制，则在任 一时间的菌浓可用下式表示： Xt＝X0＋Y（S0-St） 式中 X0，——菌的初始浓度，g/L; Xt——t时菌的浓度，g/L; (5-7)
S0——初始基质浓度，g/L; St——t时基质浓度，g/L; 若st＝0，则其最终菌浓为Xmax，只要X0<<Xmax Xmax ≌ YS0 (5-8)