磷脂酰丝氨酸合酶酶活测定方法
磷脂酰丝氨酸是什么
磷脂酰丝氨酸是脑部神经的主要成分之一，具有营养和活化脑中各种酶的活性，可延缓神经递质的减少进程，有助于修复、更新大脑受损细胞和清除有害物质。
（3）促进用脑疲劳的恢复
缓解压力，促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪：多项研究表明，磷脂酰丝氨酸能显著降低工作紧张者体内过多的应激激素的水平，减轻压力，缓解脑部疲劳，还可以促进注意力集中、提高警觉性和记忆力，缓解不良情绪。
DG的作用主要是它能特异性激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）PKC的激活依赖于Ca2+的存在。激活的PKC与PKA一样可使多种蛋白质或酶发生磷酸化反应，进而调节细胞的生物效应。另外，DG的降解产物花生四烯酸是合成前列腺素的原料，花生四烯酸与前列腺素的过氧化物又参与鸟苷酸环化酶的激活，促进cGMP的生成。CGMP作为另一种可能的第二信使，通过激活蛋白激酶G（PKG）而改变细胞的功能。
Ca2+活化各种Ca2+结合蛋白引起细胞反应，钙调素（calmodulin，CaM）由单一肽链构成，具有四个钙离子结合部位。结合钙离子发生构象改变，可激活钙调素依赖性激酶（CaM-Kinase）。细胞对Ca2+的反应取决于细胞内钙结合蛋白和钙调素依赖性激酶的种类。如：在哺乳类脑神经元突触处钙调素依赖性激酶Ⅱ十分丰富，与记忆形成有关。该蛋白发生点突变的小鼠表现出明显的记忆无能。
T细胞抗原激活信号转导磷脂酰肌醇途径的启动
钙调磷酸酶是一种丝、苏氨酸磷酸酶而不是PTK。另一方面，与胞膜内侧相联的DAG则直接激活PKC。后面熔会捍到，钙调磷酸酶和PKC主要分别活化两种重要的转录因子NF—AT和NF—cB。因而在这一条信号转导的下游通路中，实际上再一分为二，形成钙调磷酸酶参与的途径。和PKC介导的途径。由于一个PLCγ分子可以产生很多的IP2和DAG，这就放大了传人的抗原识别信号．并保证其转导的有效性。
PS(磷脂酰丝氨酸)的介绍
PS(磷脂酰丝氨酸)的介绍1.什么是PS（磷脂酰丝氨酸）磷脂酰丝氨酸，英文名Phosphatidylserine，简称PS，又称丝氨酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能。
2.PS（磷脂酰丝氨酸）的性质是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜的内层，磷酯化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。
尤其在人体的神经系统，是大脑的细胞膜的重要组成成分之一，同时对大脑的各种功能（尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定）起到重要的调节作用，如它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。
3.PS（磷脂酰丝氨酸）适用人群○1多动症的儿童○2学习繁忙的青少年○3压力沉重的职场人群○4孕龄妇女的每日增补○5步入老年人人群每日增补4.PS（磷脂酰丝氨酸）的功效（1）提高大脑机能，改善老年痴呆症：随年龄增长，磷脂酰丝氨酸和其它重要的脑内化学物质会逐渐减少，从而导致记忆力、认知力减弱。
补充磷脂酰丝胺酸能增加脑突刺数目、脑细胞膜的流动性及促进脑细胞中葡萄糖代谢，从而使脑细胞更活跃。
意大利、斯堪的纳维亚半岛和其他欧洲国家都广泛应用磷脂酰丝氨酸补充剂来治疗衰老引发的痴呆症及老年记忆损失。
（2）帮助修复大脑损伤，磷脂酰丝氨酸是脑部神经的主要成分之一，具有营养和活化脑中各种酶的活性，可延缓神经递质的减少进程，有助于修复、更新大脑受损细胞和清除有害物质。
（3）缓解压力，促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪：多项研究表明，磷脂酰丝氨酸能显著降低工作紧张者体内过多的应激激素的水平，减轻压力，缓解脑部疲劳，还可以促进注意力集中、提高警觉性和记忆力，缓解不良情绪。
(4)最新发现 DHA与PS组合配方，在考虑到两种营养成分本身的保健作用的同时，又发挥了两者在吸收上的相互促进作用，确保营养成分的充分吸收。
抗磷脂酰丝氨酸凝血酶高的原因
抗磷脂酰丝氨酸凝血酶高的原因抗磷脂酰丝氨酸凝血酶高的原因可能与以下几个方面有关：1. 自身免疫性疾病：抗磷脂抗体综合征（APS）是由于免疫系统异常导致的自身免疫性疾病。
该疾病中，患者体内产生的自身抗体反应导致凝血系统异常，其中包括抗磷脂抗体的产生。
这些抗体可以与磷脂旧和/或凝血因子结合，导致凝血系统异常激活，加重血栓形成的风险。
抗磷脂抗体阳性是APS（或称磷脂抗体综合征）的重要诊断指标。
2. 某些感染和病毒感染：某些感染（如乙肝病毒、丙肝病毒、爱滋病毒等）可能会导致人体免疫反应异常，包括产生抗磷脂抗体。
这些抗体与第一点提到的免疫系统异常相关，会导致凝血系统异常激活，增加血栓形成的风险。
此外，某些病毒也可能通过触发炎症反应、改变血小板功能等方式影响凝血系统。
3. 其他自身免疫性疾病：一些自身免疫性疾病或系统性疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、干燥综合征等，也可能导致患者产生抗磷脂抗体。
这些抗体可以引发自身免疫反应，损伤血管内皮细胞，促进凝血系统活化，增加血栓形成风险。
4. 药物引起的血栓形成：某些药物，如口服避孕药（特别是合成雌激素配方）和长期使用某些药物（如治疗癫痫的抗癫痫药物）可能导致抗磷脂抗体阳性。
药物引起的抗磷脂抗体阳性可能与药物对免疫系统的影响有关。
5. 遗传因素：有研究表明，遗传因素可能会对患者抗磷脂抗体产生和APS的风险产生影响。
在一些患者中，遗传基因异常或多态性可能增加患者产生抗磷脂抗体的风险。
需要注意的是，抗磷脂抗体阳性并不一定导致所有患者出现血栓形成，而且出现高抗磷脂抗体的症状也会因个体差异而有所不同。
因此，对高抗磷脂抗体的患者应与临床症状以及其他相关实验结果综合考虑，如测定凝血功能、血小板数量等，以确定是否存在凝血系统异常活化和血栓形成风险。
同时，及时地进行针对性的治疗和预防，以降低血栓形成的风险是非常重要的。
细胞凋亡检测方法总结
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。
Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。
PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。
所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。
实验七 GPI-专一性磷脂酶D(GPI-PLD)活性测定
实验七 GPI-专一性磷脂酶D （GPI-PLD ）活性测定姓名：mangogola本实验采用从人胎盘膜上分离的含有GPI-Anchor 的碱性磷酸酶（Apase ）作为底物，当它与血清保温时，在去污剂的存在下，血清中的GPI-PLD 能将Apase-anchor 的磷脂酸切掉，但这并不影响Apase 的活性，却会使其亲水性发生变化。
利用非离子型去污剂TritonX-114缓冲液系统（TritonX-114在t<20℃时能与水形成均一溶液；而当t>20℃时便从水溶液中分离出来，经离心后与水相分离成两相），可分别得到具有anchor 的Apase 和酶作用后不含anchor 的Apase ，只要分别测出分相前的总活力和分相后水相中的活力，便可以计算出GPI-PLD 的活力。
Apase 测活原理是其以PNPP 为底物，在碱性条件下生成具有鲜艳黄色的对硝基苯酚（在405nm 处有特征吸收峰），因此通过测定单位时间内A405nm 的增加值计算出产物的量，从而推算出酶活力。
GPI-Anchor ：蛋白质分子的羧基端连接于一含寡糖的磷脂酰肌醇分子形成含甘油二脂的疏水Anchor ，其甘油二脂部分插入到膜的双脂层中构成膜的一部分，而蛋白质则以共价键的方式“抛锚”于膜的表面。
GPI-PLD ：寡聚糖基磷脂酰肌醇专一性的磷脂酶D ，能将游离的带GPI-Anchor 蛋白的anchor 部分的磷脂酸切下来。
ALP ：结合着GPI-Anchor 的碱性磷酸酶。
一．实验过程1. GPI-Anchor 蛋白的制备（ALP 制备）2.自然降解率测定ALP 原液100ul+2%NP-40 160ul+BufferC 1740ul 2000ul （20×）ALP （20×）25ul+ BufferC 25ul +0.8%TritonX-114 450ul 500ul （400×）从400×稀释的ALP 中分别取100ul 到总1、总2管中，置于37℃，剩余溶液于37℃水浴两分钟后12000rpm 离心两分钟，迅速置于37℃水浴，分别从中取100ul 到上1、上2按上表准备五支管，对应标号并加好溶液后，置于37℃水浴中，每管分别加入100ulPNPP ，精确反应4min ，加入2mlNaOH 以终止反应。
细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析
细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析关键词：磷脂酰丝氨酸磷脂化合物磷酸试剂细胞标准物质北京标准物质网磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氢酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，磷脂化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）是一种分子量为35～36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin-V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-／PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+／PH+)：而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+／PI-)。
Annexin-V可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。
由于融合蛋白Annexin-V-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：1，还可进行定量检测。
除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。
磷脂酶D制备及催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究的开题报告
磷脂酶D制备及催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究的开题报告题目：磷脂酶D制备及催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究的开题报告一、研究背景及意义磷脂酶D是一种广泛存在于动物、植物和微生物等生物体中的一种水解酶，具有极高的催化活性和特异性。
它可催化磷脂酰胆碱转化为酰胆碱和嘌呤酸蛋白二磷酸（PIP2）转化为二酰甘油酸和嘌呤酸蛋白一磷酸（IP3），在细胞信号转导、代谢、细胞膜形成等方面发挥重要作用。
同时，磷脂酰丝氨酸是一种重要的生物活性物质，在多种生物学过程中起着重要作用，如：细胞信号转导、凝血、炎症等。
因此，研究磷脂酶D的制备和催化合成磷脂酰丝氨酸具有重要的科学研究和应用研究价值。
二、研究现状及不足目前，关于磷脂酶D的制备和催化合成磷脂酰丝氨酸的研究已有一定进展。
磷脂酶D的制备方法主要包括酵母表达系统、原核表达系统、哺乳动物免疫系统等。
催化合成磷脂酰丝氨酸的方法主要有光化学法、酶法、化学法等。
虽然已有不少研究，但还存在以下问题：1. 磷脂酶D的高效表达和纯化方法尚需改进，现有方法存在经济不便、纯化效果差等问题。
2. 目前，磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的方法主要围绕酶法展开，但其成本较高，使用范围有限。
3. 催化合成磷脰酰丝氨酸的方法还存在一定的不稳定性与选择性不高等问题。
三、研究内容及方法本研究旨在通过表达系统制备高效纯化的磷脂酶D，确定最适化合成磷脂酰丝氨酸的条件，探讨磷脂酚D在合成磷脂酰丝氨酸过程中的催化机理。
具体研究内容和方法安排如下：1. 利用酵母表达系统和分子分离开发高效的纯化技术。
2. 寻找最适合磷脂酶D减少剂的浓度和反应条件，对磷脂酶D的催化活性和特异性进行分析。
3. 通过荧光共振能量转移技术研究磷脂酰丝氨酸合成的催化机制，采用原位红外光谱技术对催化物质的特征进行分析。
四、预期结果1. 建立高效、经济、高纯度的磷脂酶D制备和磷脂酰丝氨酸催化合成方法。
2. 探究磷脂酶D在催化合成磷脂酰丝氨酸中的机理。
3. 为磷脂酶D和磷脂酰丝氨酸的应用研究奠定基础。
第20章-抗磷脂抗体和抗磷脂抗体综合征193-203
第二十章抗磷脂抗体和抗磷脂抗体综合征北京协和医院张奉春磷脂是指分子中含有醇、脂肪酸和磷酸基团的一类化合物。
人体内的磷脂主要是含有甘油醇的甘油磷脂，包括心磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆固醇，磷脂酰乙醇胺等组成。
抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，aPLA）是一族针对带负电荷磷脂或带负电荷磷脂与蛋白复合物的异质性抗体。
一些aPLA在体外可以使磷脂依赖的凝血试验时间延长，故可采用凝固法检测，所检测的aPLA称为狼疮抗凝物（1upus anticoagulant，LA）。
抗磷脂抗体综合征（antiphospholipidsyndrome，APS），是一组与抗磷脂抗体有关的自身免疫性疾病，典型的临床表现有动脉静脉血栓、血小板减少以及习惯性流产。
APS患者血中检出aPLA是确立APS诊断的必要条件。
临床上应用最广泛的是抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，aCLA）和LA。
第一节历史回顾1907年Wassermann将患有先天性梅毒胎儿的肝脏提取物作为抗原检测梅毒患者血清中的抗体，1941年Pangborn证实这种抗原是一种磷脂，将其命名为心磷脂。
后来发现有许多梅毒血清反应阳性的人并没有梅毒，故称此现象为“梅毒血清反应生物学假阳性（BFP-STS）”，与感染性疾病有关者称“急性BFP-STS”，“慢性BFP-STS”指BFP-STS在血中持续存在数月或数年。
1950年Moore等人发现慢性BFP-STS人群中自身免疫性疾病的患病率很高，其中系统性红斑狼疮（SLE）尤为突出，高达33％～44％。
1957年Conley 和Hertman报道了2例BFP-STS阳性SLE患者，在其血浆中发现了一种特异的抗凝物质，Mueller等人也观察到类似的现象，这种抗凝物质也存在于一些非SLE患者中，尽管如此Feinstein和Rapaport仍将此物质命名为狼疮抗凝物（LA）。
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磷脂酰丝氨酸合酶（pss)酶活测定方法
1.pss催化的转酯反应
取1ml 酶液进行反应, 利用HPLC 外标法测定产物磷脂酰丝氨
酸生成量, 从而计算底物大豆卵磷脂的转化率。6h 后, 测定转酯反应
共生成的磷脂酰丝氨酸量。
在本实验中, 酶活反应在下述体系中进行反应: 30ml 的0.1mol/L
醋酸钠缓冲液( pH5.5) 中含有0.15mol/L 丝氨酸, 同时加入1ml 纯化
后的重组磷脂酰丝氨酸合成酶, 与15ml含有0.75mmol 卵磷脂的氯
仿行混合, 在30℃下200r/min 混合得到均匀的乳状液进行反应。反
应6h 后, 停止转动, 双液相静止分层。提取1ml 有机相, 经挥发后,
剩余物经氯仿洗涤两次, 最后溶解于50μl 氯仿中,HPLC 法分析产
物生成量。采用的流动相为乙腈: 甲醇: 85%磷酸=100: 10: 0.8, 检测
波长206nm, 样品进样量15μl, 流速为1.0ml/min, 利用外标法( 以磷
脂酰丝氨酸标准品为外标物) 计算底物卵磷脂的转化率。
磷脂酰丝氨酸合成酶的酶活定义为: pH5.5、30℃下, 每小时转化
1μmol 大豆卵磷脂所需要的酶量( mg) 。
2.酶联比色法
pss催化水解L-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下
生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯
酚生成醌亚胺显色物质，在A=500nm下具有吸光值。
反应体系：将220mg的L-α-卵磷脂溶于含有3mL50mM的SDS
溶液、6mL1MNaOAc缓冲液（pH=8.0)、39mL的去离子水、
0.272mL17.9%的乙醇溶液（终浓为1%）的混合体系作为底物溶解液。
将39mg4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化酶溶于5.5mL的
100mM Tris HCl (pH=8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶
液、0.3mL的500mM CaCl2 溶液、0.2mL的去离子水混合并置于35℃
反应10min,沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL 2M Tris HCl
(pH=9)缓冲液，混合并离心后，上清用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤
液2mL与0.1mL胆碱显色剂、0.1mL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h.
在反应混合物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶
液，最后于A500nm 检测吸光值。
酶活定义：pH=8.0、T=35℃时，磷脂酰丝氨酸合成酶1h内催化
水解L-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量。