第10章 微生物与基因工程

第10章

微生物与基因工程上海交通大学生命科学技术学院

微生物与基因工程

第一节基因工程概述

第二节微生物与基因工程工具酶 第三节微生物与克隆载体

第四节微生物作为克隆载体的宿主 第五节基因工程的常用技术和方法

第一节

基因工程概述

重要发现

DNA特异切割：上世纪50年代发现R&M系统 DNA分子克隆：1972年Cohen & Boyer

DNA序列测定：1975年Sanger、1977年Gilbert

DNA的体外扩增（PCR）

DNA的合成技术

DNA的定位诱变技术

片段和载体连接，成为重组DNA。

通过转化、转染或转导等方式，将重组载体导入受体细胞中，获得克隆。控制表达条件，使外源基因在特定的宿主中表达，得到基因工程产品

基因工程药物：胰岛素、干扰素、重组疫苗

基因治疗：RNAi

转基因植物：抗虫、抗病

转基因动物：

抗病毒水稻

可产生基因工程药物的羊带有人类激素基因的小鼠

第二节微生物与基因工程工具酶

二、DNA连接酶（DNA ligase）

T4 DNA连接酶

两种常用连接酶

大肠杆菌DNA连接酶

在体外将目的基因和载体共价连接构成

重组DNA分子

常用的几种体外DNA连接方法：

a）用T4或E.coli连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；b）用T4连接酶连接具有平末端的DNA片段；

c）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。

d）将粘性末端补平或修平（用单链酶，如绿豆芽核酸酶）连接

第三节微生物与克隆载体

基因工程的常用载体：

质粒载体λ噬菌体载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体

真核细胞的克隆载体

人工染色体噬菌粒载体

√

√

与溶原性相关的基因可以被外源DNA取代而不影响λ噬菌体的感染、复制和裂解宿主细胞的能力。

t经过体外基因操作和包装后形成重组噬菌体，可以通过正常的感染途径进入宿主细胞；

t重组噬菌体DNA也可不经过体外包装而直接通过转染方式进入宿主细胞；

基因文库（Gene Libraries）

质粒和噬菌体载体都可用于构建基因文库；

但后者更有优势：

容纳的外源

以感染途径进入宿主细胞的效率比转化高；

三、柯斯质粒载体柯斯质粒载体

（cosmid vector），

又称粘粒，是由λ噬菌体的

粘性末端和质粒构建而成。

Cosmid

(cos site-carrying plasmid)

带有粘性末端位点( cos)

的质粒

M13

造后建成，其特点是虽然克隆外源DNA

300

别适合用于制备克隆基因的单链DNA

主要被用于制备测序用单链

模板、特异的单链

行定位诱变等，也可用于噬菌体

展示（

五、噬菌粒载体

丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。

YAC

第四节微生物作为克隆载体的宿主

二、常用的基因工程宿主

1）大肠杆菌

2）枯草芽孢杆菌

3）酿酒酵母

4）动物细胞

特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚