慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤讲课教案

一、包装细胞293T细胞的培养

一、293T细胞的冻存

1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏

1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下

5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),

5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and

5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)

2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)

3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)

4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)

用于包装的293T细胞的培养

用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。

慢病毒的包装

1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到18ml。另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13. 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化

方法一超速离心沉淀法

1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。

13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

方法二PEG-8000浓缩法

PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。

5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃。

1. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；

3. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4. 4度放置过夜；

5. 4度，4000 g，离心20min；

6. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；