血小板蛋白质组学

血小板蛋白质组学 摘要：血小板是无核的细胞碎片，传统的细胞分子生物学技术在血小板的研究中已显得不适合。在血小板的研究中，对mRNA进行研究虽然可以获得许多有价值的信息，但血小板活性的迅速改变并不取决于或者说依赖于基因表达的调节。与此相反，与基因组学相对应的蛋白质水平的研究，即蛋白质组学，为血小板生物学研究注入新的活力。从血小板活化和粘附时发生的亚事件到血小板聚集和分泌及释放，它可以对血小板各种功能反应所涉及的蛋白质进行全面综合的分析和描述。如果我们了解了每种蛋白质的功能以及蛋白质变化的调控机制，那么许多蛋白质本身就可能用作治疗性药物或者成为诊断及治疗研究的新靶点。本文对蛋白质组学在血小板研究中的应用情况作一综述，简要介绍血小板生物学研究中使用的多种蛋白质组学研究方法，包括：血小板蛋白质的记录、凝血酶激活的酪氨酸激酶信号网络以及血小板活化后释放的蛋白质的分析。蛋白质组学是一门年轻的学科，在血小板研究领域中相关文献报道较少。 关键词：蛋白质磷酸化；血小板；蛋白质组学；分泌蛋白谱 前言 一个有机个体、细胞或组织的蛋白组是指在特定时间其基因组所表达的全部蛋白质，包括不同种类的多种蛋白质。对人类基因组进行测序看起来是巨大的工程，但毕竟可以完成。相反，一个生物个体的蛋白质组具有高度可变性，可以出现无限多的组合。仅一个哺乳动物的细胞在某一时刻明显表达的基因就超过10,000个。而每一个基因可以有不同的转录、不同的翻译方式、不同的翻译后修饰，从而有可能产生数百种不同功能/结构的蛋白质。这种多变性可以解释人类基因组有近一百万种蛋白质产物。蛋白质组学研究就是要尽可能将这些蛋白质分离出来并加以鉴定。而且由于蛋白质表达谱随时间不断变化并且在不同细胞器之间移动，蛋白质组学也要在空间及时间上研究各种生物事件。蛋白质组学研究也可促进对蛋白质间相互作用及蛋白质复合物的研究，即便这种相互作用或复合物形成是短暂的。蛋白质的表达、分布、变化和相互作用研究是无法单凭基因组学研究实现的，因而，蛋白质组学在提供功能性信息方面优于基因组学。蛋白质组学研究为人类疾病诊断及治疗学的发展提供了全新的机会。对于血小板尤其如此，因为血小板蛋白表达谱较易获得且较简单，而且血小板蛋白组不受基因表达的影响（起码在体外实验时如此）。 血小板蛋白质的分离和鉴定 蛋白质组学研究基于多种技术如：二维电泳分析(two-dimensional electrophoresis，2-DE)、多维色谱分析（multidimensional chromatography）、差异图像分析（differential image analysis）、质谱分析（mass spectrometry）以及蛋白质数据库和表达序列标签（expressed sequence tag ，EST）数据库的联合应用。这种技术联合变革了传统的蛋白质鉴定方法，可以对大量蛋白质有效地进行综合分析。 广泛应用的高分辨二维电泳（High-resolution 2-DE）是根据蛋白质不同特性将蛋白质在两个不同方向上分开。首先根据分子的等电点将其分离，而后在另一方向上根据分子量的大小分离。应用该技术，每种细胞可以得到一个特异性的点图模型。用专业的成像系统对得到的点图模型进行比较。将蛋白质点切割下来用序列特异性蛋白水解酶消化，后进行质谱分析加以鉴定。近年来“变焦距”及窄谱PH值凝胶的发明和固相化PH梯度等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）的引进增加了二维电泳的分辨率和可重复性。图1a所示的是一份人血小板蛋白质二维电泳图，图中数百个蛋白质点清晰可见。蛋白质的分离也可用另外一种方法：多元正交液相色谱（liquid chromatography，LC）分析加质谱分析。首先根据静电荷用强阳离子交换树脂将蛋白质分离，然后用反相高效液相色谱分析（reverse-phase high-performance liquid chromatography）将不同疏水性的蛋白质分离，然后进行串联质谱分析（tandem MS analysis）（图2）。这种方法可用于自动分析并可分析二维电泳不能检测的跨膜蛋白质分子和碱性蛋白质分子。 就蛋白质分析的特异性和灵敏性而言，质谱分析是目前独一无二的，是蛋白质组学研究的中心。近来的发展使质谱分析在蛋白质混合分析中具有高度的准确性、敏感性和分辨率，而且可以实现自动化高流量分析，从而成为不可比拟的先进技术。质谱分析技术不直接测量离子的分子量，而是通过测量分子量与电荷比例来间接测量。使蛋白质带电荷的方法有多种。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight，MALDI-TOF－MS）分析就是其中一种，它可以提供精确的肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）。一般来说，肽指纹图谱包括目的条带的切割和凝胶内酶溶，后者需要序列特异性蛋白水解酶如胰蛋白酶，它可以将蛋白质分解成特定的一系列或单一的肽段而构成质谱指纹，再将该质谱指纹与蛋白质序列数据库检索得到的理论肽质谱相比较，最符合的蛋白质列为候选蛋白质。图1(b)所示的是经胰蛋白酶消化的一个蛋白质条带的肽指纹质谱，将这个由MALDI-TOF－MS得来的指纹质谱与蛋白质数据库的信息相比较得知它是细胞骨架蛋白中的肌动蛋白。

图1：a）：人血小板特异性蛋白质组：100μg血小板提取物经二维凝胶电泳（第二维上是10% PAGE）分离并Sypro Ruby染色，可以清楚地看到数百个蛋白质点。b）：肌动蛋白的质谱识别图：肌动蛋白在基质辅助的激光解吸飞行时间质谱（matrix-assisted laser-desorptin ionization time of flight mass spectrometry ，MALDI-TOF）质谱分析前先进行凝胶中消化和洗脱。将所得质点与蛋白质序列数据库中的理论肽质点比较。 肽指纹质谱技术是进行高通量蛋白组分析的主要方法。但是为了准确识别蛋

白质，常常需要蛋白质序列的信息。多区段设备如四极杆－飞行时间质谱仪（quadropole time-of-flight，Q-TOF）首先在一个区段将消化的多肽片段分离而生成肽段质谱，再在下一个区段使某一多肽片段经过碰撞诱导游离（collision-induced dissociation）分成更小的片段从而提供氨基酸序列的信息。以所得质谱与经专门算法（如Sequest）而得的肽段质谱进行比较。这种分析方法可以鉴别是蛋白质还是一条多肽链。想进一步了解质谱分析技术和质谱仪，读者可以参考文献12。 肽质谱分析鉴别蛋白质需要一个肽段匹配低限（一般需要3～6个）并且分析长度至少要蛋白质的30％。减少污染如角蛋白、增加凝胶容量、优化蛋白水解酶或联合使用蛋白水解酶、优化肽段回收、提高质谱分析的精确度以及在检索数据库时选用合适的多肽分子量耐量（mass tolerance）可以增加肽质谱分析对蛋白质的鉴定。进行质谱分析的理想样品是呈现考马斯兰染色的亮点，因为多肽提取物由于大片段留在凝胶中提取不完全而染色很低（有时约1%）。但是即便最好的分析策略也可能出现错误，因为质谱分析所得的某些氨基酸片段太短了。 血小板蛋白质组学：血小板蛋白质的鉴定 血小板来自骨髓中成熟巨核细胞的胞质碎片，因而无核。所以激动剂对血小板的效应没有基因表达调节的参与。尽管对血小板mRNA的研究提供了许多有用的信息，也有证据表明血小板可以合成蛋白质；但是蛋白质组学对血小板研究尤其是其信号传导系统的研究来说具有巨大潜能。虽然有许多关于血小板生物学的研究，目前为止，得以鉴定的血小板蛋白质仍然为数较少。近20年来，二维电泳已用于血小板研究，有些研究首先使用了质谱分析。有研究用二维电泳方法研究膜蛋白表达，也有学者对凝血酶和钙离子导入剂A23187激活前后的血小板总蛋白质和细胞骨架蛋白表达谱进行了研究。使用质谱分析以前的其他一些研究应用二维电泳分离血小板多肽，并且用蛋白质免疫印迹法和N端序列分析法由血小板骨架蛋白二维电泳图谱鉴定出了25种血小板蛋白质(http://www.expasy.ch/ch2d/)。 图2：应用多维层析法（multidimensional chromatography）及串联质谱分析鉴定的血小板分泌蛋白谱。凝血酶激活后的血小板分泌蛋白组先用胰蛋白酶消化，所得多肽经强力粒子交换和反相液相色谱7次洗脱后直接用于质谱分析。(a)单次洗脱后总的粒子层析图谱。分泌蛋白组的多肽片段析出层析柱形成质谱。(b)自动选择的单个粒子进行质谱分析，图中所示的是用SEQUEST程序鉴定的IPESGGDNSVFDIFELTGAARK肽链，这一肽链来自血小板分泌的血小板反应蛋白。m/z是分子量／电荷。

当血小板为凝血酶激活后有蛋白质移动到肌动蛋白细胞骨架上，基于质谱分析的蛋白质组学研究已经用来研究这些蛋白。这些研究在MALDI-TOF－MS靶盘打点（target-plate spotting）时采用了新的浓缩及纯化方法。该研究将反相层析珠加入凝胶中的稀释蛋白消化物中作为肽吸附装备。提取这些珠子后直接用于靶盘，从而避免了消化混合物中的缓冲液和溶质（chaotropes）的影响。 Marcus等在2000年制备了血小板胞质蛋白质图谱并且用MALDI-TOF法鉴定了186种蛋白质(pI 3–10)。迄今对血小板蛋白组研究规模最大的是同时用宽和窄的pI范围进行的二维电泳，检测出2300种不同的pI范围不等的蛋白质。其中有536种是用Q-TOF进行高通量串联质谱分析得到的。本试验在pI为4～5的二维电泳图中鉴定出了284种酸性蛋白质，对应于123个不同的阅读框。鉴定