体外诊断试剂胶乳比浊法学习
一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用与流程
一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用与流程1胶乳增强免疫比浊试剂的介绍胶乳增强免疫比浊试剂是一种常用于免疫学实验中的试剂，它可以被用来检测特定抗原或抗体的存在，尤其是在生物医学和生命科学领域中应用广泛。
该试剂由胶体金、珠光体、荧光素、光散射物等成分组成，能够通过增强散射和吸收等光学效应，从而提高检测的灵敏度和可信度，并且还能够保证试剂稳定性和可重复性。
2胶乳增强免疫比浊试剂的稳定方法为了保证胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性，通常采用以下方法：2.1抑制氧化反应某些成分在氧化反应的作用下会失去活性，因此可采用添加还原剂来抑制氧化反应。
通常使用亚硫酸钠、硫代硫酸钠等还原剂，可以有效地抑制氧化反应。
2.2控制温度和光照温度和光照会对试剂的稳定性产生影响，因此需要控制环境温度和光照强度。
通常把试剂置于暗处或遮光袋中，避免直接照射光线。
2.3添加保护剂添加保护剂能够保护试剂免受外界环境的影响，一些常用的保护剂有甘露醇、丙二醇、山梨醇等。
这些保护剂能够减轻试剂在储存和运输过程中受到的压力，从而延长试剂的使用寿命。
3胶乳增强免疫比浊试剂的应用流程胶乳增强免疫比浊试剂的应用流程包括以下几个步骤：3.1试剂前处理使用前，需要将胶乳增强免疫比浊试剂离心，将沉淀物均匀悬浮于试剂中。
3.2样品处理制备样品液，通常需要对样品进行稀释、加热、离心等操作，以获得更加准确的测量结果。
3.3加试剂将胶乳增强免疫比浊试剂加入样品中，混合均匀后进行孵育。
3.4测量结果测量反应产物的比浊度、荧光强度等参数，并进行数据分析和结果判定。
4胶乳增强免疫比浊试剂的应用胶乳增强免疫比浊试剂的应用范围非常广泛，通常用于以下方面：4.1检测抗体和抗原胶乳增强免疫比浊试剂可以用于检测特定抗体或抗原的存在，常常被应用于医学诊断、生物工程等领域。
4.2生化分析胶乳增强免疫比浊试剂能够用于测定肽、多肽、蛋白质、脂质等生化物质的存在和浓度。
4.3分子识别胶乳增强免疫比浊试剂可以用于基因测序和DNA分析等领域，为了识别特定的分子，可以在试剂中加入标记物质并进行检测。
胶乳透射免疫比浊法-国家食品药品监督管理总局
目前胱抑素 C 含量的测定方法主要是基于抗原抗体反应的
— 1 ——
免疫方法，如胶乳免疫比浊法、胶体金免疫比色法、 单向免疫扩
散法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等，
免疫比浊法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。 其中透射
免疫比浊法可适用于半自动生化分析仪、 全自动生化分析仪， 散
用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据， 并依据产品
的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件， 不涉及
注册审批等行政事项， 亦不作为法规强制执行， 如有能够满足法
规要求的其他方法， 也可以采用， 但应提供详细的研究资料和验
证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
的变化，加入标准溶液后样品总浓度必须在试剂检测线性区间
内）或纯品，每个浓度重复检测 3 次，按公式（ 2）计算回收率，
结果应符合产品技术要求性能指标的要求。
R=[C ×（V 0+V ）－ C0×V 0） ] / （ V ×CS）×100% 式中：
（ 2）
R —回收率；
V —加入标准溶液的体积；
V 0 —人源样品的体积； C —人源样品加入标准溶液后的检测浓度；
6840。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、
生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等
内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》 （国家食品药品监
督管理总局令第 5 号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资
料要求和批准证明文件格式的公告》 （国家食品药品监督管理总
意义。
注：若注册申报产品声称临床意义超出此内容范围， 应提供
07 B2MG
复星长征体外诊断试剂标准操作规程试剂名称：β2-微球蛋白测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)上海复星长征医学科学有限公司目录1 试剂盒概况2 方法学原理3 试剂主要组分4 样本准备5 试剂准备6 校准要求7 质量控制8 计算方法9 参数设定10 参考范围11 试剂性能概要12 超出可报告范围的处理13 其他必须说明的内容14 参考文献1 试剂盒概况1．1 货号：1.06.2201/1.06.2202。
1．2 包装规格：试剂1（R1）：2×60mL、试剂2（R2）：2×15mL试剂1（R1）：3×40mL、试剂2（R2）：1×30mL试剂1（R1）：2×250 测试、试剂2（R2）：2×250 测试。
1．3 医疗器械注册证书编号沪食药监械（准）字2014 第2400935 号1．4 产品标准编号YZB/沪6953-40-20142 方法学原理试剂（盒）采用胶乳免疫比浊法。
样本中的β2-MG 分子与试剂中包被于胶乳微粒上的抗β2-MG抗体结合，形成抗原抗体复合物，产生浊度变化。
胶乳试剂可以特异增强浊度变化，从而增大试剂的灵敏度。
反应过程中产生浊度变化的高低与样本中β2-微球蛋白的浓度成正比。
通过在600nm 处测定吸光度的变化值，即可测得样本中β2-微球蛋白的浓度。
3 试剂主要组分3．1试剂1（R1）: PBS 缓冲液50 mmol/L3．2试剂2（R2）: 包被β2-MG抗体胶乳3．3 储存条件3．3 . 1 在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自生产之日起效期12个月。
3．3 . 2 试剂启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定30 天。
4 样本准备适用于新鲜血清或血浆样本。
如当天采集样本不能及时测定，请保存于-20℃5 试剂准备试剂为液体双试剂形式，无须特别准备，可直接上机使用。
6 校准要求6．1 校准品：选择使用商品化的β2-微球蛋白校准品。
糖化血红蛋白测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求lepu
糖化血红蛋白测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血中的糖化血红蛋白的浓度。
1.1规格试剂1: 1×30mL，试剂2a: 1×9.5mL，试剂2b: 1×0.5mL，试剂3: 2×50mL。
1.2主要组成成分试剂1主要组分：试剂2a主要组分：试剂2b主要组分：试剂3主要组分：2.1 净含量应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观试剂1应为无色或浅黄色澄清液体，试剂2（a、b）应为无色或乳白色澄清液体，试剂3(又称前处理液)应为无色或淡黄色澄清液体。
外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白在660nm处测定试剂空白吸光度，应≤1.5；2.4 分析灵敏度测试5.0%的被测物时，吸光度变化（ΔA）应不低于0.0019。
2.5 准确度参照EP9-A2的方法，用比对试剂盒同时测试40例线性区间内的不同浓度的血清样本。
其相关系数（r）不小于0.990。
每个浓度点在[1.0,2.0)%区间内绝对偏差不超过±0.24%；[2.0,16]%区间内相对偏差不超过±12%。
2.6 重复性批内变异系数（CV）应不超过10％。
2.7 线性2.7.1在[1.0,16]%区间内，线性相关系数r应不低于0.990；2.7.2 [1.0,1.92)%区间内绝对偏差不超过±0.23%；[1.92,16]%区间内相对偏差不超过±12%。
2.8 批间差对同一份样品进行重复测定，相对极差≤12％。
2.9 稳定性取在2℃～8℃条件下贮存达到12个月后的试剂进行检测，应符合本标准2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7之规定。
免疫胶乳比浊法与分光光度法
免疫胶乳比浊法与分光光度法第一部分：引言免疫胶乳比浊法与分光光度法是生物化学领域中常用的两种实验方法，用于测定抗原与抗体的结合反应。
本文将通过深度和广度的方式，对这两种方法进行全面评估，探讨它们的原理、优缺点及在实验中的应用。
第二部分：免疫胶乳比浊法的原理与应用1. 免疫胶乳比浊法是一种常用的生物化学分析方法，利用抗体特异性结合抗原后形成胶乳凝集沉淀，通过光学测定凝集度来确定抗原或抗体的含量。
2. 该方法具有操作简单、结果稳定可靠的优点，广泛应用于临床诊断、生物制药等领域。
3. 但是，免疫胶乳比浊法也存在着检测范围窄、灵敏度不高等缺点，需要在实际应用中慎重选择。
第三部分：分光光度法的原理与应用1. 分光光度法是利用物质对特定波长的光吸收或透过特性进行定量分析的方法，适用于测定浓度较低的样品。
2. 该方法具有高灵敏度、分辨率高的优点，广泛应用于生化实验、药物检测等领域。
3. 但是，分光光度法在样品处理、稀释等方面需要严格控制，且需要专业的设备和操作技能。
第四部分：免疫胶乳比浊法与分光光度法的比较1. 免疫胶乳比浊法和分光光度法各有其适用的范围和优势，需要根据具体实验要求进行选择。
2. 在实验设计中，我们应该充分考虑到样品性质、检测目的、操作条件等因素，选择最合适的方法进行分析。
3. 两种方法的综合应用可以弥补彼此的不足，提高实验的准确性和可靠性。
第五部分：个人观点与总结对我来说，免疫胶乳比浊法和分光光度法是两种非常重要的生化实验方法，它们在科研和临床诊断中都发挥着重要作用。
通过不断学习和实践，我逐渐深入理解了这两种方法的原理和应用，也体会到了它们的优势和局限性。
在未来的实验中，我将更加灵活地根据具体情况选择合适的方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结语：通过对免疫胶乳比浊法和分光光度法的全面评估和比较，相信读者们对这两种方法有了更深入的了解。
在实验过程中，选择合适的方法对于研究的顺利进行至关重要，希望本文能为大家在科研和实验中提供一些帮助和启发。
甘胆酸测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求乐普(北京)诊断技术
甘胆酸测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中甘胆酸的含量。
1.1 包装规格试剂1: 2×45mL，试剂2: 2×15mL；试剂1: 1×45mL，试剂2: 1×15mL；试剂1: 4×40mL，试剂2: 4×10mL；试剂1: 2×40mL，试剂2: 2×10mL；试剂1: 2×40mL，试剂2: 2×8mL；试剂1: 1×40mL，试剂2: 1×8mL；试剂1: 1×21ml，试剂2: 1×7ml。
1.2 组成成分2.1 外观和性状试剂1：无色澄清液体，无沉淀、无悬浮物、无絮状物。
试剂2：乳白色液体，无沉淀、无悬浮物、无絮状物。
外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.2 净含量用通用量具测量，液体试剂的净含量应不少于标示值。
2.3 试剂空白吸光度600nm波长下，试剂空白吸光度，应≤2.0。
2.4 分析灵敏度样本浓度在20mg/L时，吸光度变化值为0.0030-0.3000。
2.5 准确度参照EP9-A2的方法，与已上市产品进行比对试验：用比对试剂盒同时测试40例线性范围内的不同浓度的血清样本，在（0，80]mg/L范围内，其相关系数r≥0.990；在（0，8]mg/L线性范围内，绝对偏差不超过±1.8mg/L，在（8，80]mg/L线性范围内，相对偏差不超过±15%。
2.6 重复性使用同一样品重复测定10次，其测定值的批内变异系数（CV）应不大于6％。
2.7 线性2.7.1 在（0，80]mg/L范围内r应≥0.990；2.7.2 在（0，8]mg/L线性范围内，绝对偏差不超过±1.8mg/L，在(8，80]mg/L 线性范围内，相对偏差不超过±15%。
2.8 批间差随机抽取3批试剂盒，重复测定同一血清样本或质控，其结果的批间相对极差（R）应不超过10％。
TnI胶乳比浊试剂使用注意事项
TnI胶乳比浊试剂使用注意事项一、TnI 项目的特殊性1、临床重要性——作为诊断“金标准”，临床希望100%准确。
2、标准未统一——各厂家均自己定值，无法溯源。
不同厂家结果无法直接比较。
3、项目特殊性——正常结果理论值应为“0 ”。
4、方法复杂性——使用速率比浊法，多点定标。
二、准确性问题1、任何检测都不可能100%准确，从统计学可知，敏感性和特异性都达到95%的实验方法（即各有5%的假阳性和假阴性）就是非常好的方法。
临床大多数检测（包括心电图）是达不到两个95%的。
提高敏感性就意味特异性降低。
所以，假阳性和假阴性是难以完全避免的。
2、标准尚未统一，很难简单判定哪家结果准确。
应通过临床验证判断结果的准确性。
三、引起cTn升高的非心肌缺血状况和疾病必须十分清楚的认识到除了心肌梗塞外，还有一些情况会导致心肌受损而引起cTn水平的升高。
例如：外伤（包括挫伤，切除、电击伤、心肌活检、心脏手术等），充血性心衰（急性或慢性），高血压，低血压伴心率不齐，非心脏手术病人手术后，肾衰，糖尿病，甲状腺机能减退，心肌炎，肺栓塞，脓血症，烧伤，淀粉样变性病，急性神经系统疾病，心肌受损后的横纹肌溶解，衰竭等。
高值原因细分析，排除其他揪“真凶”（高风险心梗病例）四、少数假阳性的判断专家建议排除AMI同时使用至少两个心肌指标专家建议：排除AMI不能基于一个样品的单独检测结果，应至少使用2个心肌指标，如：一个早期指标（小于6小时，肌红蛋白）和一个确认指标（在6-9小时升高，高度灵敏和特异，并有较长的持续时间，肌钙蛋白）。
复查结果不可缺、临床诊断少差错1、标本本身造成的假阳性(1)标本中颗粒性物质可明显干扰反应（如乳糜血、纤维蛋白、促凝胶等颗粒物），此类物质本身是颗粒，影响浊度,从而使ABS升高；(2)类风湿因子, 类风湿因子可与IgG抗体的FC段结合导致胶乳聚集，出现假阳性；(3)异嗜性抗体（体内相对稳定），某些人体内存在的对异种动物蛋白的抗体。
胶乳增强透射免疫比浊法与电化学发光免疫分析法检测癌胚抗原结果比对
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｄｕｃｔｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎｌａｔｅｘｅｎｈａｎｃｅｄｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｉｎ ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｒｉｃａｎｔｉｇｅｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０４ ｒａｎｄｏｍ ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｂｏｔｈｌａｔｅｘｅｎｈａｎｃｅｄｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｓｅｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＳｐｅａｒｍａｎｗａｓ０．９９８．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌａｔｅｘｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙｓｙｓｔｅｍ ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ ｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｌａｔｅｘ ｅｎｈａｎｃｅｄｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｉｓｗｏｒｔｈｙｔｏｐｏｐｕｌａｒｉｚｉｎｇｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｃｏｐｅｏｆｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｈｏｕｌｄｂｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｐｒｉｍａｒｙｈｏｓｐｉｔａｌｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｒｅｇｉｏｎｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌａｔｅｘｅｎｈａｎｃｅｄｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ； Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ； Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；
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胶乳免疫比浊法相关知识很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目,关注胶乳标记技术得技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术,并加以分类,以便朋友们查阅:胶乳微球物理吸附:反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面得都就是疏水微球,都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷得磺酸基团,pkａ大约为2,因此在酸性ｐH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团,但能与蛋白行程共价键、羧基微球表面含带负电荷得羧基基团,在pＨ５.0以上时保持稳定。
带有疏水基团得蛋白得吸附与配位结合,就是最简单与直接得标记方法。
这种方法中,微球溶液与含目标蛋白得溶液混合,反应后,未结合得游离蛋白通过清洗步骤除去,从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰得微球)。
醛基表面修饰微球就是一个特例,其疏水吸附结果取决于后来得共价结合。
虽然物理吸附就是不依赖pH得,但反应缓冲液得pH对蛋白得结构有非常大得影响,从而影响蛋白吸附到微球上得反应效率。
一般,在被吸附蛋白等电点附近pH时,物理吸附效率会很高。
反应步骤:1、用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml;２、用反应缓冲液系数胶乳微球到１%;3、将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中,10mｌ胶乳中加入1ml蛋白溶液。
室温搅拌孵育２hr;4。
离心或超滤,除去未结合蛋白;ﻫ5。
将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。
注意事项:1。
最优蛋白标记量影响因素1)有效比表面积:粒径减小时,比表面积/mg微球值得增加;2)胶体稳定性:蛋白对胶乳有稳定与去稳定作用;ﻫ３)免疫反应:最近标记量由免疫反应需要决定。
2、胶乳微球中加入蛋白后,快速搅拌混合,利于反应均衡、反应体积就是1ml时,可用移液器吸取蛋白加入微球中,并吹打数次。
如果反应体积较大时,用烧杯,边搅拌边加入蛋白,３、储存缓冲液与反应缓冲液不同时,抗体有脱落得可能;ﻫ4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落,所以应避免加入。
ﻫ微球共价结合抗体方法:一、一步法１。
准备50ｍM pH６。
0得ｒeacｔｉｏn buffeｒ,醋酸或MＥS ｂuｆｆer更合适2.用reａcｔｉｏｎｂuffeｒ溶解抗体,使其浓度为１mｇ/mL。
ﻫ３、用reａctiｏn buｆfer 悬浮微球,使其浓度为1％ｗ/v4、边搅拌边将一倍体积得抗体溶液加入到10倍体积得微球悬液中,室温下持续搅拌２0分钟ﻫ５、准备浓度为10ｍg/ｍl(５2umol/mL)得EDC溶液,用前准备,现配现用、ﻫ６。
将计算需求量得EDC溶液加入到上述微球悬液中。
(Note６)。
7、室温下,立即调节pＨ(Ｎｏte 7)。
8、移除未结合得蛋白,并将包被微球用ｓtorage bufｆer重悬。
(Nｏte 3 and4)ﻫB. 两步法为了避免EDC将相邻微球之间得蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流,两步法偶联抗体更合适、两步法中,在蛋白加入之前,多余得ＥDC被移除。
两步法中,蛋白也可以使用更高pH得ｂuffer来溶解,从蛋白得稳定性方面与加速蛋白与活化微球之间得交联速度方便考虑,就是非常有利得、B1 简单一步法:1、准备５0ｍＭpH6、0得活化ｂｕffer,醋酸或MＥS buffeｒ更合适;用活化buffer 悬浮微球,使其浓度为1% w/v2.每ml微球悬液加入2０mg得ＥDＣ,室温孵育20分钟,然后再次加入２0mg/mL得EDC,继续室温孵育２0分钟。
(Ｎote 7).ﻫ3。
离心或超滤,用等体积得包被缓冲液清洗两次微球,最后悬浮在包被缓冲液中、(Notｅ3)。
ﻫ4。
用包被缓冲液溶解抗体到１mｇ/ｍL,包被缓冲液pH７~9,浓度为５0mM～１０0ｍM。
(Note 1)ﻫ5.将抗体快速加入得搅拌中得微球悬液中,持续搅拌,室温孵育2~5小时、(Nｏte ２).ﻫ6、每mｌ反应溶液中加入2。
５ｕl得乙醇胺,持续搅拌并室温孵育10分钟、(Note9).ﻫ7。
离心或超滤,用储存缓冲液悬浮,重复两次,移除未结合得抗体与乙醇胺。
(Note 3 aｎd４)B２、NHS中间活化酯两步法在此方法中,在EDAＣ存在下,ＮHＳ通过与微球上得羧基反应形成中间活化酯。
活化酯比EＤＣ更稳定,不易水解。
ﻫ1。
每ml反应混合物加入以下成分:？加入DＩW,定容最终体积为1ｍl;ﻫ？0。
1mｌ10Ｘ得MEＳbufｆeｒ,ph6.０~6、5(10X得bｕ0、1mｌ10％得微球(终浓度为1％);ｆfer通常用０。
５M);ﻫ?？０、２3mｌNHS水溶液(50mｇ/mＬ);11。
5mｇﻫ？一定体积得19、２ｍg/ml(100mM)得EＤAＣ水溶液;2.室温下搅拌反应15～３0mｉn;(Note7)ﻫ3、清洗:MES buffer或ＤＩW清洗两次;(Noｔｅ3);4.用DIW冲悬浮微球到浓度为1%;5.同时,用包被ｂuffer溶解稀释抗体。
buｆfer一般为ph7～９,50mM~10０mM。
最终得蛋白浓度1mg/mL; ６。
清洗完微球后,立即加入一定体积得抗体溶液、(Note 2)。
(注意:此处给出得例子,微球浓度与蛋白浓度与buffer分别为0。
5％(w/v),0。
５mg/mＬ,25～５0mM);７、室温下搅拌孵育２hｒ;8、每ml反应液中加入2。
5mｌ乙醇胺,室温搅拌孵育10～３0miｎ;ﻫ9、清洗:stｏｒagｅbufｆer 清洗两次。
(Note３/４)NＯTＥS:ﻫ1。
rｅacｔion ｂufｆｅr得组成根据蛋白种类得不同而改变,常用bufｆer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。
蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上,因为在等电点附近,蛋白表面会有更多得疏水位点暴露出来。
在这种情况下,抗体也更紧密,因此需要更多得抗体用于标记到微球上。
然而,最终reactioｎbufｆeｒ得选择,需要考虑最终抗体微球复合物得生物活性,因此,几个不同浓度得抗体与不同pH得反应ｂｕffｅｒ应该进行优化选择。
起始实验,反应buｆfｅr得离子强度应该在25～50ｍM。
2、蛋白溶液应该在快速得搅拌下,快速加入到微球悬液中。
小体积得话,可以进行斡旋混合。
当大体积时,应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些,蛋白溶液快速加入到漩涡中间。
3.移除未结合得化合物或蛋白,如果颗粒直径大于0.2um,可以通过离心得方法,微球可以重新悬浮,然后搅拌,接着温与得超声分散、离心力不宜过大,这样会导致微球不易分散。
也可以用超滤或透析来纯化。
当用超滤时,滤膜孔径应该足够大,使得游离得蛋白能自由得通过滤膜。
用于清洗微球得bufｆer应该与storage buffer一样、用于清洗得buｆfer得任何缓冲液成分及pH得改变,都会引起蛋白得脱落。
ﻫ4。
微球包被抗体后,加入表面活性剂或者去污活性成分,可能会导致抗体脱落。
如果就是共价结合到微球上,共价结合得抗体就不会有脱落现象发生。
封闭蛋白,像BSA,ｃaｓeiｎ或ｇｅｌatin可以用来封阻任何空余得疏水性位点,防止微球发生非特异性凝集。
但就是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固得抗体洗脱下来。
ﻫ5。
此试剂与水反应,因此,溶解后应立刻使用掉。
６。
EＤC得用量,根据微球表面羧基浓度来计算。
根据计算所需量,每moｌ得羧基应该再多加2~３mo ｌ得EDC。
但就是,根据功能性检测结果,还需要进一步得优化。
ﻫ7.此步骤,微球得凝集经常能观察到。
因为接下来得步骤中,ＥDＣ会将相邻两个微球上得抗体连接起来从而引起微球凝集或者中与微球表面得羧基或者两者情况都发生、调节pH到６、5或超过6.５,优化共价反应,对微球得分散有帮助、如果反应结束后微球凝集现象仍然发生,用新鲜得bufｆｅｒ清洗除去多余得EDC与游离得蛋白,一般会使得凝集颗粒再分散、如果在最终得产品中凝集依然发生,尝试稀释微球,一开始可以稀释到原来得５0%浓度。
如果稀释后凝集依然发生,可以尝试在所有ｒｅacｔioｎbuffｅｒ中加入Tweeｎ20或Tergｉtol NP9等非离子型表面活性剂。
这些表面活性剂不会干扰颗粒得活性或共价结合,但就是需要注意得就是,要确保在这种去污剂存在下微球共价结合得抗体得稳定、ﻫ9。
加入乙醇胺,可以与加入蛋白反应后多余得羧基位基团反应。
胶乳标记过程中常见问题:1)问题:蛋白无法吸附到微球上。
解决方法:加入更多得蛋白;去除微球中得表面活性剂,释放其占据得蛋白结合位点;引入中间物,将微球与蛋白相连;改变缓冲液、２)问题:标记时加入了大量得蛋白,但就是仍然无活性。
ﻫ解决方法:改变蛋白加入量,从而改变蛋白与微球结合得空间构象;使用表位稀释物,占据微球上得部分蛋白结合位点,防止蛋白靠得太近。
3)问题:清洗去除未吸附蛋白后,微球聚集。
ﻫ解决方法:增加蛋白标记量或封闭剂得用量,防止有空余位点;4)问题:标记后开始活性很好,储存一段时间后,活性降低。
解决方法:降低储存温度到２～８度;降低储存液中得封闭剂浓度,防止抗体被替换;确认储存液中无能与抗体竞争得杂质,防止长时间取代抗体。
5)PS微球与蛋白(抗体)交联后,当时没发现有凝集,但隔夜后发现有凝集ﻫ就是偶联效率低得原因。
当体系蛋白不足或就是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时,由于这些基团又可以与相连微球上得蛋白反应,结果就是把球又拉在一起了,所以有聚集、可以加一些bｌoｃker ａｇｅｎｔｓ解决,常见得就是BSA,另外,也可提高微球得交联率、但为什么就是过一段时间后才出现凝集呢,这就是因为微球偶联上蛋白后,相互之间由于携带同种电荷得关系,比较稳定(所以能以胶体样存在),只有当偶尔相互碰撞,遇上彼此得反应基团时才能结合。
６)抗体偶联至羧基PＳ球,即时检测效果很好,但置于3７度2天后,抗体活性似乎下降很大、可能共价结合未成功,如果就是这样,那么最主要得原因就是EＤAC质量差或过期了。
EDAC长期放在空气中会吸潮,水汽会降低ＥDAＣ活性。
另一个可能原因就是凝集。
观察胶乳就是否有凝集产生。
还有,交联蛋白前有没有清洗？我们提供得胶乳缓冲液中含有表面活性剂,可能干扰抗体得结合。
如果未发生凝集,而且用前已经清洗,那么我们建议换新得ＥDAC、７)EDC活化羧基乳胶微球后,加蛋白(抗体)即时有沉淀出现,就是什么原因？很多因素可以导致蛋白加入后,微球聚集成块。
通常,蛋白偶联前得聚集与缓冲液(电解质)有关。
可能就是羧基没有活化好。
ＥDC质量出现问题了,请换质量好得再尝试。
如果没有好得EＤC,可以适当调低活化缓冲液得pH值。
ﻫ对非修饰微球,那么可以从以下方面着手解决:绝大多得微球制备过程中,加有脂肪酸乳化剂。
在聚合时,它起乳化作用,在聚合后,它起稳定剂作用,使微球以胶体样分布。
在碱性pH下,微球表面得CＯOH,脂肪酸分子上得COOH以及聚苯乙烯多聚链末端得硫酸根(SO４2—)使微球表面带负电荷,亲水性增强,从而能形成稳定得胶体。