慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装实验技术方法
慢病毒包装实验技术方法慢病毒一般为HIV等为基础改造的接近无毒，感染后不进行复制的稳转株构建运载体。
可以将目的基因携带并整合到细胞的基因组中，持续表达（普通转染一般只表达数天，随着分裂质粒会渐渐被稀释掉），进行长期试验。
慢病毒包装的过程和转染相似，主要区别在于慢病毒包装一般为多质粒混合转染（不同质粒含有病毒的不同元件），多个质粒的总质量和PEI的质量以及转染过程都与普通转染无异。
不同的是一般在转染后48h后，也就是换液后的30小时，收集细胞上清作为病毒的粗制品，来感染目的细胞。
以研发为目的的小规模生产是采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统（Cell Factories, Cell Stacks）或HYPERFlask的贴壁细胞。
采用传统的磷酸钙转染或者最近发展起来的PEI转染来转染最佳密度的细胞(<50%),后者的优点是不依赖培养条件、转然后不需要换液及可用于悬浮细胞转染。
原则上，小规模生产也可以采用阳离子转染试剂如lipofectamine、fugene及293fectin,它们转染也都获得了高水平表达。
通过比较不同的细胞培养系统，Aububel等并没有发现所评估的培养系统(培养瓶，一层或十层细胞工厂)所产生的慢病毒滴度有任何差异。
利用HYPERFask，Kutner等发现采用HYPERFask培养可以比用传统培养装置培养所产生的慢病毒每个表面单位高10倍，原因可能是前者有更高的氧气利用率。
此外，HYSPERFask生产的慢病毒比传统培养皿生产的慢病毒所含细胞蛋白、核酸污染更低。
HEK293T细胞贴壁不牢，所以采用转瓶培养生产慢病毒时更困难，同时为了要保证细胞贴壁，转染条件的优化要更加小心。
在这种背景下，Patel等证实在HEK293中过表达alpha-v和beta-3整合素可以提高细胞贴壁能力，进而提高转瓶中慢病毒的产率。
然而，这种方法需要采用过表达整合素的重组HEK293。
293系列的细胞都是非常好转染的。
慢病毒滴度测定方法简介
慢病毒滴度测定方法简介(表达荧光的慢病毒)Day 0：将生长状态良好的293T 细胞消化计数后稀释至1⨯105/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1⨯104个细胞)，每种病毒需要6个孔。
放入37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。
Day 1: 在EP 管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备6个1.5 ml EP 管，每管加入90 μl完全培养基，往第一个管中加入10 μl病毒原液，混匀后，吸取10 μl 加入第二个管混匀。
以此类推。
然后把稀释好的病毒和细胞孵育过夜。
Day 2：吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μl 完全培养液，以利于细胞的生长。
Day 3：显微镜观察荧光。
此时荧光会有初步表达。
Day 4：在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10-30%之间）的孔进行细胞计数，并计算滴度。
其计算公式如下:滴度（TU/ml）=细胞数⨯荧光百分比⨯103/病毒原液体积(μl)。
举例：③号管对应孔的荧光比例为30%，细胞总数为8⨯104，滴度（TU/ml）=8⨯104⨯30%⨯103/0.1=2.4⨯108如果要感染2×105个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒粒子）（见下注），则需要病毒体积为=2×105⨯30/2.4⨯108（ml）=0.025 ml=25 μl.注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。
各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。
干扰慢病毒设计、合成及包装的具体方法及步骤
干扰慢病毒设计、合成及包装的具体方法及步骤
1.shRNA序列设计与合成
（1）客户提供干扰序列；
（2）针对目的基因中洪代为设计并合成三对特异性的siRNA序列，根据siRNA序列设计对应茎环结构的shRNA序列，然后合成三对shRNA序列（结果中保证其中一条干扰效率不低于70%）。
2.shRNA慢病毒载体构建
将三个shRNA分别克隆入慢病毒载体，构建shRNA干扰慢病毒载体，并进行测序鉴定构建成功。
二、目的基因干扰慢病毒载体的包装和浓缩
1.慢病毒载体的大量包装
大量扩增效率三组shRNA慢病毒载体和慢病毒的辅助质粒，将三个质粒按一定比例大量转染293T细胞，进行慢病毒颗粒的大量包装。
2. 慢病毒的浓缩
包装48小时后收集病毒，并对病毒进行体外大比例浓缩，得到有效滴度为10^8PFU/ml的慢病毒颗粒。
293T细胞中包装慢病毒实验方案
慢病毒包装实验⽅方案实验步骤⼀一、细胞培养1、⽤用含10%FBS的H-DMEM培养基于37°C、5%CO2培养箱中培养293T细胞，其中加1×102U/ml⻘青霉素、100µg/ml链霉素和10µg/mlciprofloxacin防⽌止⽀支原体污染，2、待10cm⽫皿中细胞融合度到80%左右，⽤用0.25%胰酶消化293T细胞，分到两个6cm⽫皿中，另⼀一盘10cm293T作同样处理理，使细胞在接种之后的18-24h达到70%融合度。
●注意事项293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停⽌止使⽤用抗⽣生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过⾼高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。
⼆二、细胞转染3、每个6-cm培养⽫皿在转染之前4h⽤用5ml不不含⾎血清的H-DMEM培养基换液，4、应⽤用500µl Optimum和14.18µl Lipofactamine2000混匀于室温静置5min，将500µl Optimum、1.7µg慢病毒载体、1.13µg psP AX2和0.57µg MD2.G混匀配制成DNA mixture，然后与静置5min的Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20min后，将混匀后的mixture加⼊入到培养基中。
5、6h之后将培养基更更换为含10%FBS的H-DMEM完全培养基，6、分别收集48h、72h和96h的细胞上清液。
●注意事项①293T细胞容易易脱落⽫皿底，加H-DEME沿⽫皿侧壁缓慢加⼊入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布⽫皿底防⽌止细胞⽆无培养基死亡②质粒换算要准确，③将mixture加⼊入培养基中要边滴边摇晃培养⽫皿使其mixture与培养基混匀，这样直⾄至结束。
三、病毒收集和浓缩1、将离⼼心机时间和转速参数调⾄至成3000rpm和15min,其中加速度和下降速度降⾄至最低，2、将收集的293T细胞上清液加⼊入超滤管中（⼀一次最多15ml）,3000rpm、15min开始离⼼心，离⼼心结束后⽤用收集病毒，-80℃保存。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
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一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844) 用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达到100%。
慢病毒的包装1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。
2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。
3. 第二天，镜下检查细胞。
细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。
4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLT R-G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到18ml。
另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。
将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。
来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。
每一皿细胞培养盘不要超过6盘。
8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。
9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。
如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。
在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。
12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13. 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。
如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二PEG-8000浓缩法PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃。
1. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；4. 4度放置过夜；5. 4度，4000 g，离心20min；6. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio，终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。
每个样品管中加入200μl 洗脱液洗下DNA。
用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。
基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。
震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。
震荡后放在冰上。
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。
从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。