利用粳稻基因组DNA和Cot-1 DNA探针对普通野生稻和亚洲栽培稻的比较分析

第３１卷第２期　２０１２年６月　中南民族大学学报（自然科学版）　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．２　

Ｊｕｎ．２０１２　

利用粳稻基因组ＤＮＡ和Ｃ。　一　ＤＮＡ探针　对普通野生稻和亚洲栽培稻的比较分析　覃瑞　，李智　，刘　虹　，陈雁　，蔡朝晖　，李　刚　（１中南民族大学生命科学学院，南方少数民族地区生物资源保护与综合利用联合工程中心，武汉４３００７４；　２咸宁学院化学与生命科学学院，咸宁４３７１００）　

摘　要　以粳稻日本晴基因组ＤＮＡ和Ｃ　ｔ—Ｊ　ＤＮＡ为探针，分别对日本晴、籼稻广陆矮４号和普通野生稻的染色体　组进行了基因组原位杂交（ＧＩＳＨ）和Ｃ　ｔ—Ｊ　ＤＮＡ荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）分析，并对３种染色体组进行了同源聚类和　比较研究．结果表明：粳稻基因组ＤＮＡ和Ｃ　ｔ—Ｊ　ＤＮＡ探针信号在３种水稻染色体组中的分布状况和覆盖率相似，　Ｃ。ｔ—Ｊ　ＤＮＡ的覆盖率分别为（４７．１３±０．１８）％、（４５．８９±０．２２）％、（４４．２４±０．２１）％，３种水稻基因组同源性高，亲　缘关系接近．Ｃ。ｔ—ｊ　ＤＮＡ在３种水稻染色体上的杂交信号分布各有特点，中高度重复序列的变异在普通野生稻向栽　培稻进化和亚洲栽培稻籼、粳分化过程中具有重要意义，中高度重复序列含量较低的２、５、８号染色体是水稻染色　体组进化过程中相对活跃的成分．　关键词Ｃ　ｔ一　ＤＮＡ；基因组；核型；水稻；普通野生稻　中图分类号　Ｑ８１３．４　文献标识码Ａ文章编号　１６７２－４３２１（２０１２）０２－００２４－０５　

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ　Ｇｒｉｆｆ．ａｎｄ　Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｗｉｔｈ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃ　ｔ．１　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｑｉｎ　Ｒｕｉ　，Ｌｉ　Ｚｈｉ　，Ｌｉｕ　Ｈｏｎｇ　，ＣｈｅｎＹａｎ　，Ｃａｉ　ｚｈａｏｈｕｉ　，Ｌｉ　昭　（１　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｉｎ　Ｅｔｈｎｉｃ　Ａｒｅａ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ—Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ　４３００７４，Ｃｈｉｎａ；　２　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｘｉａｎｎｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｎｎｉｎｇ　４３７１００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｕｓｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃ。ｔ—Ｊ　ＤＮＡ　ｏｆ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　ａｓ　ｐｒｏｂｅｓ，ＧＩＳＨ（ｇｅｎｉｍｉｃ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ａｎｄ　Ｃ　ｔ　Ｊ　

ＤＮＡ　ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ｗｅｒｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｓｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｏｆ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，ｉｎｄｉｃａ　Ｇｕａｎｇｌｕａｉ　４　ａｎｄ　Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ　Ｇｒｉｆ．ｋａｒｙｏｔｙｐｅ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　３　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｍａｄｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃ　ｔ—Ｊ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ　ｉｎ　３　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｖｅｒｙ　ｓｉｍｉｌａｒ．Ｔｈｅ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　Ｃ。ｔ—Ｊ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，Ｇｕａｎｇｌｕａｉ　４　ａｎｄ　Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ　Ｇｒｉｆ．　

ｗｅｒｅ（４７．１３±０．１８）％，（４５．８９－￣－０．２２）％ａｎｄ（４４．２４±０．２１）％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃｌｏｓｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｍ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ａｎｄ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｐｌａｙｅｄ　ａｎ　ｉｍｐｏ￣ａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｉｃａ－ｊａｐｏｎｉｃａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｉｎｃｅ　ｔｈｅｉｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｈａｄ　ｔｈｅｉｒ　ｏｗｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎ　ｌｅｓｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ａｎｄ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｎｏ．２、５、８）ａｒｅ　ｍｏｒｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ’Ｓ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｃ。ｔ—Ｊ　ＤＮＡ；ｇｅｎｏｍｅ；ｋａｒｙｏｔｙｐｅ；ｒｉｃｅ；Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ　Ｇｒｉｆ．　

稻属（Ｏｒｙｚａ　Ｌ．）隶属禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）稻族　（Ｏｒｙｚｅａｅ　Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ），含有２个栽培稻种和２０多个　野生稻种…，广泛分布于全球热带和亚热带地区．　籼稻（ｉｎｄｉｃａ）和粳稻（ｊａｐｏｎｉｃａ）代表了栽培稻中２个　

收稿日期２０１２－０３－２２　通讯作者李刚（１９６８一），男，副教授，研究方向：植物遗传资源，Ｅ－ｍａｉｌ：　作者简介覃瑞（１９７１一），男，教授，研究方向：植物细胞遗传，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｒｕｉ１９７２２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎ　基金项目　湖北省自然科学基金资助项目（２００８ＣＤＢ３９２）　

ｌｇ８６３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ａｎ　

ｅｎ　第２期　覃瑞，等：利用粳稻基因组ＤＮＡ和Ｃｏｆ一』ＤＮＡ探针对普通野生稻和亚洲栽培稻的比较分析　２５　具有一定生殖隔离的基因库，是亚洲栽培稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）分化最深刻和最主要的２个方向．因此，　籼粳分化是水稻起源研究的一个重要方面　］，利用　其遗传差异进行杂交获得较高的杂种优势是实现水　稻超高产育种目标的有效途径　Ｊ．　基因组原位杂交（ＧＩＳＨ）是基于荧光原位杂交　（ＦＩＳＨ）发展起来的一种原位杂交技术，它能快速、　有效地鉴定基因组结构和各基因组之间的亲缘关　系Ｌ４　Ｊ．Ｃ。ｔ一　ＤＮＡ主要为中高度重复序列，包含卫星　ＤＮＡ，微卫星ＤＮＡ，核糖体ＤＮＡ及端粒、着丝粒等　重复序列．Ｃ。ｔ－　ＤＮＡ　ＦＩＳＨ即利用一个基因组或种　的Ｃ。ｔ—　ＤＮＡ为探针与另一个基因组或种的染色体　进行荧光原位杂交，通过中高度重复序列在自身或　者另一个物种基因组染色体上的分布情况　］，反映　物种基因组之间的关系．同时在杂交后洗脱时调整　洗脱严谨度，将那些同源性不高的探针从基因组　ＤＮＡ上去除以分辨同源性高者．　前人曾利用基因组中的重复序列研究水稻基因　组遗传分化，如Ｒ．Ｓｈｉｓｈｉｄｏ　等利用ＳＳＲ标记，对　取自缅甸的１６种普通野生稻个体进行了分类．　Ｈｕａｎｇ　等发现转座子插入多态性导致籼粳稻在基　因组上约１４％的差异．虽然上述研究利用了基因组　中的重复序列，但均为重复序列中的特定种类，个性　强而共性不足，不能完全体现重复序列在不同基因　组上的变化，故本文利用能代表基因组中所有中高　度重复序列的Ｃ。ｔ—　ＤＮＡ为探针，结合ＧＩＳＨ和　ＦＩＳＨ手段对日本晴、籼稻广陆矮４号和普通野生稻　的染色体组进行比较基因组学分析，探讨中高度重　复序列在水稻籼粳分化中所起作用．　１材料与方法　１．１材料、试剂和仪器　栽培稻籼稻“广陆矮４号”由湖北省农业科学　院曾左葵研究员提供．栽培稻粳稻“日本晴”和中国　普通野生稻由武汉大学生命科学学院何光存教授提　供．中期染色体制片参照Ｙａｎ¨８　和Ｓｏｎｇｌ９　的方法．　琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ）、核酸酶（２Ｕ／ｌ￣ｇ　ＤＮＡ，Ｐｒｏｍｅｇａ），平移试剂盒（Ｎｉｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｒｏｃｈｅ），生物素化ｄＵＴＰ（ｂｉｏ－１１一ｄＵＴＰ，华美生物工　程公司），甲酰胺、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ），硫酸葡聚糖　（Ａｍｒｅｓｃｏ），纤维素酶（Ｃｅｌｌｕｉａｓｅ　Ｏｎｕｚｕｋａ　Ｒ一１０，中科　院上海生化所），果胶酶（Ｓｅｒｖａ），链亲和素一Ｃｙ３　（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—Ｃｙ３，Ｒｏｃｋｌａｎｄ）．　Ｃｏｏ１．１３００ＱＳ　ＣＣＤ相机（含Ｃａｓｅ　Ｄａｔａ　Ｍａｎａｇｅｒ　Ｅｘｐｏ　２．１。１软件，ＶＤＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＢＸ５１、ＢＸ６１荧光　显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）．　１．２　Ｃ　ｔ—　ＤＮＡ的制备　ＣＴＡＢ法提取栽培稻“日本晴”总ＤＮＡ，参照文　献［１０］改良Ｃ　ｔ—　ＤＮＡ制备参照Ｚｗｉｃｋｌ１１］等的方　法．将总ＤＮＡ于０．１４Ｍｐａ高压下灭菌３～１５ｍｉｎ，打　断成８００～１５００ｂｐ长的片段．根据Ｃ　ｔ－　ＤＮＡ动力　学公式Ｃ。ｔ＝ｃＤＮＡ（ｍｏｌ／Ｌ）×　（Ｃ。ｔ＝１，　＝１／　ｃ。　），计算Ｃ。ｔ一　ＤＮＡ完全复性所需的时间．Ｃ。ｔ—　ＤＮＡ完全复性后，用ｓ１核酸酶３７￣Ｃ酶解１ｈ，平衡　酚抽提，无水乙醇沉淀过夜，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心　１０ｍｉｎ，７０％乙醇洗涤，最后于ＴＥ溶液中溶解得所　需Ｃ。ｔ一，ＤＮＡ．　１．３探针标记与检测　Ｃ　ｔ．　ＤＮＡ采取切刻平移试剂盒方法标记．　５０ｔｘｌ反应体系中含有ｄＮＴＰｓ、ｂｉｏ－１１一ｄＴＵＰ、ＤＮａｓｅ　Ｉ、　ＤＮＡ聚合酶Ｉ和０．２～０．５Ｉｘｇ探针ＤＮＡ，１５ｏＣ下标　记３．５ｈ后，６Ｏ℃水浴１０ｍｉｎ终止反应，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ纯化，抗生物素蛋白的碱性磷酸酶点印迹法　检测标记效果．　１．４荧光原位杂交及检测　ＧＩＳＨ和ＦＩＳＨ分别参考文献［１２］和［１３］改良．　染色体制片于６Ｏ℃下烤片ｌ　ｈ，ＲＮａｓｅ　Ａ／２×ＳＳＣ　（１ＯＩｘｇ／ｍＬ，含０．１５　ｍｏＬ／Ｌ　ＮａＣ１和０．０１５　ｍｏｌ／Ｌ柠　檬酸钠）３７ｏＣ处理１ｈ；２×ＳＳＣ室温漂洗１０ｍｉｎ；　ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ胃蛋白酶，５ｍｇ／Ｌ　ＨＣ１　３７ｃＩ＝处理７～８ｍｉｎ；　２×ＳＳＣ室温漂洗１０ｍｉｎ；７０％甲酰胺６４℃下变性　４ｍｉｎ（普通野生稻６８ｏＣ，４ｍｉｎ）；一２０℃７０％、９５％　和无水乙醇各洗脱５　ｍｉｎ，室温晾干．每张片子杂交　液含１００　ｎｇ标记的探针ＤＮＡ、５０％去离子甲酰胺、　８％硫酸葡聚糖、１０％２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２１ｘｇ鲑鱼　精ＤＮＡ，３７℃杂交过夜．　杂交信号的荧光检测：４２℃用３０～４０％甲酰胺　（据Ｍｅｉｎｋｏｔｈ＆Ｗａｈｌ的严谨度公式，增加甲酰胺、　降低ＳＳＣ比例，可增加洗脱严谨度　１４］），２×ＳＳＣ，　０．２×ＳＳＣ各洗脱１０ｍｉｎ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００处理　５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗脱１０ｍｉｎ；晾干后每张片子加链亲和素一　Ｃｙ３，３７℃保温皿中温育ｌ　ｈ．ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ．　４０　Ｌ　ＤＡＰＩ（１Ｏｍｇ／Ｌ）复染，荧光显微镜观察并　摄图．　１．５软件分析　用ＳＰＯＴ　ａｄｖａｎｃｅｄ软件测量染色体长度和计算　杂交信号区域面积，用ＦＩＳＨ　Ｖｉｅｗ　ＥＸＰＯ　２．０软件进　行图片处理和核型分析¨　，用Ａｕｔｏ　ＣＡＤ　２００８软件