水稻稻瘟病抗性基因Pi_ta的SNP检测方法_张羽

水稻稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ的ＳＮＰ检测方法张羽１　张晓娟１　杨凤娇２　冯志峰３（１陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中７２３０００；２北京林业大学，北京１０００８３；３陕西省汉中市农业科学研究所，陕西汉中７２３０００）ＳＮＰ－ｂａｓｅｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｒｉｃｅ　Ｂｌａｓｔ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅ　Ｐｉ－ｔａＺＨＡＮＧＹｕ１，ＺＨＡＮＧＸｉａｏ－ｊｕａｎ１，ＹＡＮＧＦｅｎｇ－ｊｉａｏ２，ＦＥＮＧＺｈｉ－ｆｅｎｇ３（１Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ　７２３０００，Ｃｈｉｎａ；２Ｂｅｉｊｉｎｇ　ＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ；３　Ｈａｎｚｈｏｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ　７２３０００，Ｃｈｉｎａ）ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏｊｕａｎ，ＹＡＮＧ　Ｆｅｎｇｊｉａｏ，ｅｔ　ａｌ．ＳＮＰ－ｂａｓｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｂｌａｓｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅＰｉ－ｔａ．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ，２０１３，２７（３）：３２５－３２８．Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｏｎｌｙ　ｏｎｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｉｃｅ　ｂｌａｓｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　Ｐｉ－ｔａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ａｌｌｅｌｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｉｓ，ａ　ＳＮＰ－ｂａｓｅｄ　Ｐｉ－ｔａ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｅｓｔａｂｉｓｈｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ　ＡＲＭＳ　ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｉ－ｔａ　ｇｅｎｅ　ａｍｏｎｇ　６２ｒｉｃｅ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｆｒｏｍ　ｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｉｃｅ　ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒＹａｎｇｔｚｅ　Ｒｉｖｅｒ　ｉｎ　２０１２ａｎｄ　９７ｒｉｃｅ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｆｒｏｍ　ｒｉｃｅ　ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｉｎ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｉｎ　２０１２ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ＳＮＰ　ｍａｒｋｅｒ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｉ－ｔａ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｅ　ｂｌａｓｔ；Ｐｉ－ｔａ；ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ；ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ张羽，张晓娟，杨凤娇，等．水稻稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ的ＳＮＰ检测方法．中国水稻科学，２０１３，２７（３）：３２５－３２８．摘　要：针对稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ位点上的抗感基因的编码产物仅有１个氨基酸的差异，利用已经建立的检测该基因的ＳＮＰ方法以及作者在该基因编码序列构建的四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ，对６２份２０１２年长江上游国家水稻区域试验材料和９７份陕西省水稻区域试验材料进行了Ｐｉ－ｔａ基因检测，２种分子标记检测结果一致。

该方法的检测结果真实可靠，可以用于检测水稻Ｐｉ－ｔａ基因位点。

关键词：稻瘟病；Ｐｉ－ｔａ；检测方法；单核苷酸多态性中图分类号：Ｓ４３５．１１１．４＋１；Ｓ５１１．０３４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－７２１６（２０１３）０３－０３２５－０４ 稻瘟病是造成水稻严重减产的主要病害之一，在全球８５个水稻种植国家和地区都有发生。

每年因稻瘟病导致的生产损失约占总产量的１０％～１５％［１］。

目前控制稻瘟病最好的方法是发掘广谱稻瘟病抗性基因或主效ＱＴＬ，通过聚合育种，得到广谱持久抗病的水稻品种。

因此，抗性基因分析以及抗源筛选就显得尤为重要［１－６］。

２０世纪６０年代中期，日本率先开展了水稻品种稻瘟病抗性基因分析的研究工作，截至２０１２年６月，已至少报道了６３个抗稻瘟病位点共７７个主效基因。

随着分子标记种类和数量的不断增加，稻瘟病抗性基因的定位及克隆得到了迅猛发展［７－１１］。

研究表明，稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ位于水稻第１２染色体靠近着丝点附近的区域，定位于ＢＡＣ克隆ＢＡＣ１４２Ｅ８［１２］上的ＲＦＬＰ标记ＲＧ２４１与ＲＺ３９７之间，遗传距离分别是５．２ｃＭ和３．３ｃＭ。

Ｐｉ－ｔａ基因包含２个外显子和１个１　４６３ｂｐ的内含子，编码一个长度为９２８个氨基酸的细胞质膜受体蛋白。

Ｐｉ－ｔａ位点上抗感基因的编码产物仅有１个氨基酸的差异，由于出现了一个单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ），即由密码子ＧＣＴ变为ＴＣＴ，第９１８个氨基酸位点由抗病产物的丙氨酸变异为感病产物的丝氨酸［１３］。

时克等［１４－１６］研究表明，主效抗稻瘟病基因Ｐｉ－ｔａ在中国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性，被广泛应用于中国的水稻育种和生产。

ＳＮＰ主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的ＤＮＡ序列多态性，这种变异可由单个碱基的转换或颠换引起，也可由碱基的插入或缺失所致。

它是继第一代分子标记限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和第二代分子标记微卫星多态性（即简单序列重复ＳＳＲ）这２类遗传标记之后出现的第三代分子遗传标记，具有分布广泛、数量多、遗传稳定等特点。

２００５年发表的水稻基因组序列全图显示，籼、粳稻间ＳＮＰ位点多达８０１２７个，平均每１５４个碱基就存在一个ＳＮＰ，ＳＮＰ频率达０．６５％，是拟南芥２个生态型Ｃｏｌｕｍｂｉａ和Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ之间ＳＮＰ频率的２０倍［１７］。

随着ＤＮＡ分子标记技术的发展，大批与稻收稿日期：２０１２－０８－０８；修改稿收到日期：２０１３－０２－１８。

基金项目：陕西省教育厅专项科研项目（１２ＪＫ０８１５）；陕西省科技厅农业科技创新项目（ＮＫＣ０１－０１）。

５２３中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ），２０１３，２７（３）：３２５－３２８ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｓｃｉ．ｃｎＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－７２１６．２０１３．０３．０１４瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记被开发，特别是一些基于抗性基因本身序列所开发的特异性分子标记（功能标记）［１８－２２］，为快速、准确、系统地鉴定抗稻瘟病基因型水稻品种以及高效开展稻瘟病抗性基因聚合育种带来了新的契机。

随着功能基因组时代的到来，ＳＮＰ作为一种高通量、能自动检测基因组中的核苷酸序列变化的标记方法，将会在水稻基因位点突变鉴定、特异基因鉴定等基因研究方面起到巨大的作用。

而四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ（ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ　ＡＲＭＳ　ＰＣＲ）是一种在普通ＰＣＲ基础上发展起来、专门用于检测ＳＮＰ的技术，它综合了扩增受阻突变体系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）和四引物ＰＣＲ（ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ　ＰＣＲ）技术的优点，能准确、快速检测ＳＮＰ，可以区分等位基因是否纯合，而且费用低廉。

本研究利用Ｈａｙａｓｈｉ等［２１］报道的检测Ｐｉ－ｔａ的特异分子标记以及作者在稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ区域设计的四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ（ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒＡＲＭＳ　ＰＣＲ）方法，探索出一套合适的ＳＮＰ检测方法，进行该基因位点检测，从而为检测稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ提供快速、有效、简单的方法。

１　材料与方法１．１　实验材料２０１２年长江上游国家水稻区域试验材料６２份和陕西省水稻区域试验材料９７份由陕西省水稻研究所提供，阳性对照材料Ｔｅｔｅｐ由国家水稻种质资源中期库提供，阴性对照材料日本晴由中国农业科学院作物科学研究所水稻种质资源中期库提供。

１．２　方法１．２．１　引物设计本研究利用２种ＳＮＰ检测方法对Ｐｉ－ｔａ进行基因分型研究，一种利用Ｈａｙａｓｈｉ等［２１］报道的编号为ｔａ５的引物对，其中敏感引物对序列为５′－ＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＡＣＧＣＧ－３′／５′－ＣＧＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣ－３′；抗性引物对序列为５′－ＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＡＣＧＣＡ－３′／５′－ＣＧＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣ－３′。

其原理如下：两条相邻的寡核苷酸与模板退火，只有当其在接合处与模板完全匹配时才会在连接酶的作用下连接在一起。

因而等位基因特异性寡核苷酸能够探察多态性位点碱基的性质。

加入两条互补于待测ＳＮＰ位点一侧序列的等位基因特异性探针和一条互补于待测ＳＮＰ位点另一侧序列的公共探针；在ＤＮＡ连接酶的作用下，与目标ＤＮＡ单链完全互补的等位基因特异性探针和公共探针发生连接反应。

连接产物变性后作为探针的模板进入下一个循环。

如果等位基因特异性探针的３′端存在错配，则不会发生连接反应，抗感引物只在３′端有一个碱基的差异，抗性引物中为Ｇ，敏感引物中为Ａ，而它们的反向引物是相同的。

同一个材料经抗性引物（Ｒ）和敏感引物（Ｓ）分别扩增，ＰＣＲ产物相邻点样，如果只有抗性引物扩增出条带，则该材料为抗性基因纯合体（ＲＲ）。

如只有敏感引物扩增出条带，则该材料为敏感性基因纯合体（ＳＳ）。

Ｒ引物和Ｓ引物都扩增出条带，该材料为抗性基因杂合体（ＲＳ）。

另一种为四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ法。

从ＮＣ－ＢＩ网站（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）ＧｅｎＢａｎｋ中得到编码稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｔａ的基因序列。

设计引物时将突变碱基落在突变引物的３′端，根据Ｔａｑ酶缺乏３′→５′外切酶活性的特点，３′末端错配碱基的引物，其延伸速度低于正常末端碱基配对的引物的延伸速度，所以特异长度的扩增条带就不会出现，从而就表明模板ＤＮＡ与引物３′末端没有相应的突变。

反之，则表明模板ＤＮＡ上存在与引物３′末端相应的突变碱基。

３′末端的碱基可以设计成与抗性基因序列完全互补而与敏感基因序列不互补，也可以设计成与敏感基因序列互补而与抗性不互补。

抗性正向引物为５′－ＣＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＴＴＴＡＣＴＴＧ－３′；敏感反向引物为５′－ＣＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡ－３′；外引物上游序列为５′－ＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴ－３′；外引物下游序列为５′－ＴＴＡＧＧＧＣＣＡＡＣＡＴＴＣＴＡＣＧＧ－３′。