分子生物学作业

一种快速简便的伪狂犬病毒EP0基因RT-qPCR检测方法的构建

1 材料与方法

1.1病毒

伪狂犬病病毒变异株JS-2012株为实验室分离鉴定并保存[15]。LLT单个启动子缺失病毒JS-L1R1 [16]、双启动子缺失病毒JS-L1R3和JS-UL1R3均由本实验构建和保存。

1.2主要试剂

反转录试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液、Trizol试剂均购自中国赛默飞世尔公司；荧光定量PCR所用试剂购自Takara公司；细胞培养基DMEM购自上海西格玛奥德里奇公司；培养细胞所用FBS胎牛血清、消化胰酶0.25%Trypsin-EDTA（1×）购自Invitrogen（美国）。

1.3接毒以及RNA的提取

接种用细胞均匀的铺在六孔板中，待细胞长至90%以上时接毒。按照1MOI的剂量接种细胞，放置细胞培养箱（37℃、5% CO2)中吸附1h后弃掉病毒液，换成含2%的FBS培养基继续放置细胞培养箱中培养。在接毒8h后按照Trizol总RNA提取液说明书提取样品的总RNA。

1.4 DNaseⅠ消化

按照DNaseⅠ消化试剂盒使用说明书进行操作，消化体系为25µL：总DNA模板为21.5μL，DNaseⅠ消化酶为1µL，10×DNaseⅠReaction buffer 为2.5µL，轻轻

混匀后放置37℃水浴30min，之后加入0.25µL的0.5M的EDTA，最后在75℃水浴10min以终止反应。

1.5反转录过程

按照反转录试剂盒说明书进行操作，反转录总体系为20µL：RNA模板为8µL，Random primer（0.1μg/μL）为1µL，RNase-free water 为3µL，轻轻混匀后放置65℃水浴5min，立即放冰上备用。然后加入5×Reaction buffer 4µL，10mmol/L dNTP Mix 2μL，Ribolock RNase Inhibitor（20U/µL）1µL，Revert Aid M-MuL VRT（200U/µL）1µL，轻轻混匀后先放置25℃反应5min，之后45℃反应60min，最后放置70℃终止反应5min。

1.6 RT-qPCR方法的构建以及优化

根据本实验室获得的两种不同剪接方式的EP0基因序列对比结果分析，采用Primer 5软件设计了荧光定量检测引物，EP0334F：5-GGAAGAGGATGAGCCGGTCT-3；EP0442R：5-GGTTCATCCCGTGCTCCTG-3。荧光定量反应体系为：2×SYBR Green Premix ExTaqTM 10µL，上下游引物均为0.4µL，cDNA为2µL，最后用RNase-Free water 补足至20µL。并设计了3个退火温度（分别为55℃、60℃和65℃），选择反应信号强度最高，Ct值最小的退火温度作为最适反应条件。

1.7病毒基因组对RT-qPCR方法的影响

提取病毒的RNA后，将所得样品分为两份处理，一份利用DNaseⅠ消化处理，

一份不使用DNaseⅠ消化，检测DNaseⅠ消化前后的RNA中EP0基因是否表达。

1.8不同反转录引物对RT-qPCR方法的影响

分别选择反转录试剂盒中的Random Primer和Oligo（dT）对所提取的RNA进行反转录，检测不同反转录引物对EP0基因表达量的影响。

1.9 EP0基因的时态表达特征

根据JS-2012的病毒滴度按照1MOI的剂量接种细胞，分别在2h、4h、8h、12h 和16h收取病毒RNA，检测EP0基因的动态表达特征。

1.10 RT-qPCR方法的初步临床应用

将JS-2012野毒和LLT启动子缺失突变病毒按照104个TCID50的剂量滴鼻接种小鼠，观察小鼠发病情况和死亡情况，并利用构建好的RT-qPCR方法检测小鼠三叉神经组织中EP0的表达量。

2 结果

2.1 荧光定量RT-qPCR构建及优化

试验结果显示：60℃退火温度条件下可获得良好的扩增效果。在这个反应条件下反应信号强度最高，Ct值最小（图1），并且溶解曲线单一、重复性较好（图2）。所以本RT-qPCR方法的最适反应条件为：95℃预变性 3min，95℃变性 15s，60℃退火 30 s，40个循环。反应体系为：2×SYBR Green Premix ExTaqTM 10 µL，上下游引物（10 µmol/L）均为0.4µL，cDNA为2µL，最后用RNase-Free water 补

足至20 µL。

2.2 病毒基因组对RT-qPCR方法的影响

为了避免病毒基因组对反转录的影响，因此本研究利用DNaseⅠ将提取的RNA 进行消化。结果显示：将DNaseⅠ处理前后的RNA分别作为模板进行qPCR，结果显示DNaseⅠ消化前后，均检测不到EP0的转录。PRV基因组DNA为模板，也检测不到EP0的转录。但是DNaseⅠ消化前后的RNA作为模板进行反转录，得到的cDNA作为模板进行qPCR结果显示在DNaseⅠ消化前后均能检测到EP0的表达，并且差异不显著。这表明，病毒基因组DNA的存在与否不影响该RT-qPCR方法的检测结果

2.3不同反转录引物对RT-qPCR方法的影响

为了提高反转录效率，因此本研究利用反转录试剂盒中提供的两种引物Random primer和Oligo（dT）分别对总RNA进行反转录，比较两种引物的反转录效率，RT-qPCR结果显示：利用Random Primer反转录，EP0的表达量显著高于Oligo（dT）反转录表达量（p<0.0001），具有统计学意义

2.4 EP0基因的时态表达特征

将亲本病毒按照1MOI的剂量接种六孔板，利用Trizol试剂收取不同时间点的细胞总RNA，利用上述构建好的RT-qPCR方法检测细胞中的EP0的动态表达情况。结果显示：病毒感染后2 h，EP0开始表达，这表明EP0是一种早期基因；在8 h 后EP0基因的表达量达到最高，之后随着时间的延长逐渐减少

3 结论

利用分子手段检测生物标志物已经成为了一种趋势，并且随着PCR技术的发展，更加精密、灵敏、高通量的PCR检测方法被开发并应用于临床监测。如数字PCR、