NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

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双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究

双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究张志忠;吴菁华;吕柳新;何承坤【期刊名称】《热带亚热带植物学报》【年(卷),期】2005(13)5【摘要】构建了同时含有番茄几丁质酶基因(Chi3)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu-Ac)的双价抗真菌基因植物表达载体,以西瓜(Citrullus lanatus)子叶块为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,将Chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培种"中育一号",共获得46株抗性再生植株.经PCR、Southern blot和RT-PCR 检测,表明外源基因已成功整合到西瓜基因组中,并在转录水平得到表达.利用尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum)对转基因植株进行离体叶片抗病性检测,表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强.【总页数】6页(P369-374)【作者】张志忠;吴菁华;吕柳新;何承坤【作者单位】福建农林大学园艺学院,福州,350002;福建农林大学园艺学院,福州,350002;福建农林大学园艺学院,福州,350002;福建农林大学园艺学院,福州,350002【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.Chi和Bar基因双价植物表达载体的构建及转基因烟草的初步检测 [J], 吴文俊;贾小霞;张金文;王汉宁2.双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测 [J], 范媛媛;庞永珍;吴为胜;姚剑虹;唐克轩;武天龙3.含 GmNHX1和 LcVP1双价基因植物表达载体构建与转基因棉花的获得 [J], 冯雪;贾永红;郭红珍;张一名;赵学良;孙艳香4.几丁质酶基因与抗真菌蛋白基因、葡聚糖酶基因双价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组 [J], 王华;周鹏;郭安平5.phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得 [J], 郑军荣;周鹏;洪葵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

植物表达载体构建

植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷组织化学染色定位法荧光法测定GUS活性分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子
目的片段
（标记基因）选择标记

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。

植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。

本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

关键词:Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。

而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。

随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。

传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。

从1969 年 Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。

本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

南京林业大学重点学科简介——林木改良与种质创新

南京林业大学重点学科简介——林木改良与种质创新江苏省重点学科——林木改良与种质创新◆学科简介本学科利用高新生物技术和系统生态理论，充分发挥苏北的光热水土资源，培育了以杨树新品种为基础、杨木加工利用为龙头的江苏杨树产业。

使昔日风起飞沙满天、碱花片片的苏北大地致富脱贫，已发展成为支柱产业。

如今，苏北大地，一片片杨树林郁郁葱葱，杨树防护林纵横交错，绵延数百公里，道路绿树成荫，一望无际。

苏北农村生气勃勃，气象万千。

这一切都是由我学科经过30多年的艰苦奋斗，将选育出一大批杨树优良品种，在苏北农村，大力推广的结果。

目前全省杨树总面积175026公顷，总蓄积量近4800万m3，每年上市的商品材近400万m3，直逼华东木材大省福建。

目前全省大中型木材加工企业30多家，加上乡镇企业数以千计，均以杨树为主要原料生产胶合板、细木工板、多层板、贴面板、刨花板、中密度纤维板等，年销售总额达92.28亿元，产品销售日本、韩国、新加坡、意大利、美国和中东地区。

当前江苏省的胶合板产量已跃居全国第一，这在江苏经济发展史上是前所未有的。

江苏省率先在全国形成了个颇具规模的新兴产业——杨树产业，并成为苏北各县的富民强县的重大举措，促进了农村经济的发展，增加了农民的收入。

除此以外，本学科在宜、溧山区和宁镇丘陵地区大面积推广杉木、马尾松、枫香和马褂木等良种，对繁荣山区经济也发挥了重要作用。

◆目前主要研究内容①利用细胞工程和基因工程技术与常规育种相结合，选育高产、优质、抗病虫害的杨树新品种；②本学科与营林、木材工业、林产化工等学科交叉渗透，用高新技术改造传统产业，开发新板种，生产高附加值的产品，提高经济效益；③对全省32个杨树基地县实行全方位的技术服务。

在淮阴、宿迁、徐州、盐城等市建立杨树良种繁育基地，形成市—县—乡（镇）良种推广体系；并在各市营造大面积的示范试验林，进行定向培育。

指导广大农民科学培育杨树，达到高产、优质和高效的目的，使农民迈上致富路，实现小康。

基因的克隆、表达载体构建及功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证基因的克隆、表达载体构建及功能验证（⼀般性⽅法）⼀、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因⼲什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备⼯作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及⽤具：枪头、离⼼管、培养⽫、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗⽣素准备※基本流程提取和纯化RNA—cDNA第⼀条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第⼀链合成1.1叶⽚、根总RNA的提取Trizol是⼀种⾼效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度⾼，以利于下⼀步的实验。

1）实验前准备O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），⾼温预先配制0.1%的DEPC⽔（ddH2灭菌后，⽤DEPC⽔配制 75%⼄醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌⾄少4 h，所⽤枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。

2)Trizol 法（⼩麦）叶⽚或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离⼼管中加⼊1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成⽩⾊粉末，移⼊管内，⽤⼒摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋⽩复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离⼼10min，取上清，离⼼得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、⾼分⼦量DNA，上清中含有RNA。

（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，⽤⼒摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。

（4）在≤12000g，4℃离⼼10 min，样品分为三层：底层为黄⾊有机相，上层为⽆⾊⽔相和⼀个中间层，RNA主要在⽔相中，⽔相体积约为所⽤TRIzol试剂的60%。

过表达载体的构建方法及步骤

过表达载体的构建⽅法及步骤⼀、载体的选择及如何阅读质粒图谱⽬前，载体主要有病毒和⾮病毒两⼤类,其中质粒 DNA 是⼀种新的⾮病毒转基因载体。

⼀个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。

原核⽣物 DNA 分⼦中只有⼀个复制起始点。

⽽真核⽣物 DNA 分⼦有多个复制起始位点。

（2）抗⽣素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因⽚段（4） P/E 启动⼦/增强⼦（5）Terms 终⽌信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作⽤选择载体主要依据构建的⽬的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的⽬的是要表达⼀个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的⽬的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能⼒－据克隆⽚段⼤⼩（⼤选⼤，⼩选⼩）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动⼦及相应的受体菌，⽤于表达真核蛋⽩质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋⽩质或融合蛋⽩作为相应载体的参考。

【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成⽅向因载体不同⽽异，适应⽬的基因与载体易于链接，不能产⽣阅读框架错位。

综上所述，选⽤质粒（最常⽤）做载体的5点要求：（1）选分⼦量⼩的质粒，即⼩载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌⾥⾯拷贝数也多（也有⼤载体）；（2）⼀般使⽤松弛型质粒在细菌⾥扩增不受约束，⼀般 10个以上的拷贝，⽽严谨型质粒<10个。

（3）必需具备⼀个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗⽣素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试⼀试）。

（5）满⾜⾃⼰的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加⼊荧光标记，是否需要加⼊标签蛋⽩，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

番木瓜PL和β-Gal基因双价反义表达载体的构建

２１００年３月
番木瓜儿和一ａ基因双价反义表达载体的构建Ｇｌ
申艳红，陈晓静，何玮毅（福建农林大学园艺学院／园艺植物遗传育种研究所，福建福州３００）５０２
摘要：已报道的番木瓜果胶裂解酶（）Ｂ半乳糖苷酶（－ａ）因序列的基础上，在和．／Ｇ／基３设计特异引物，别扩增保守区序分
番木瓜（ａｃｐｐｙ．原产热带美洲，７ＣｒａａａａＬ）ｉ１世纪传人我国，在广东、广西、云南、福建、台湾等热带亚热带地区均有栽培，果实营养丰富，药食兼用，并有广泛的化工用途，经济价值高Ｈ．】番木瓜属呼吸跃变型果实，ｌ在８℃以上，采后果实迅速成熟、软化【４番木瓜对低温敏感，３】Ｉ．不能冷藏运输，因此在运输和储藏中的损失高达２．％【．胶裂解酶（ｅｔｅｌｓ，Ｐ）通过Ｂ消除的方式催化聚半乳糖醛酸３７５果］ｐｃｔｙｅＬ能ａａ．
ＣｎｔｕｔｎｏＬａｄＢＧｌｎｉｎｅｅｐｅｓｎｖｃｏｆｐｐｙｏｓｃｉｆｎ－ａｔｅｘｒｓｉｅｔｒｏａａａｒｏＰａｓｓｏ
ＳＮＹｈｈｎ，ＨＮＸａ－ｎ，ＨｉｉＨＥａ —ｏｇＣＥｉｏｉｇＥＷｅ— ｊｙ
Ｓ，ｔｎｉｍｅｅｐｓｉｎｖｃｏｓｐＰａｄｐｒｂａｎｄｏｗｏａｔｅｘｒｓｏｅｔｒＣｎＣＧｗｅｏｔｉｅ．Ｔｈｎ，ｄＧａｔｅｓｅｅｔ５ｒｍｏｅｄＮｏｓｅｅｅＰＬａｎｉｎｅｇｎｓｗｉ３ＳｐｏｔｒａｓｎｓｈｎｔｒｎｔｒｗｒｎｅｔｔｘｒｓｉｎｖｃｏＣｅｍｉａｏｅｉｓｒｄｉｏｅｐｓｏｅｔｒｐＡＭＢＩ２０ｏｅｅｅｅａｅｄｕｌｅｅｌｔｘｒｓｉｎｖｃｏＣＧｂｉｅｅｎｅＡ３１ｔｇｔｒｔｇｎｒｔｏｂｅｇｎｓｐａｐｓｏｅｔｒＰｙｄｆｈｏｎｅｅｐ－

种子中特异表达IPT基因的植物双元载体构建及转基因水稻获得

ａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００５１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｐｅｃｉｉｃｆａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｌＰＴｇｅｎｅｉｎｔｈｅｅｎｄｏｓｐｅｒｍｏｆｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｒｉｃｅｓｅｅｄ．ｔｈｅｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐｌ３ＯＯ－ｐＰＧ－５ａ－ＩＰＴ－Ｎｏｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｉｒｆｓｔｌｙ，ｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆＰＧ一５ａｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｒｉｃｅ
ｄｏＩ：１０．７６６８／ｈｂｎｘｂ．２０１５．０１．０１０
Ⅳ ０ｓ；水稻；遗传转化
文章编号：１０００—７０９１（２０１４）０ — ００６１ — ０５
ＴｈｅＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａＶｅｃｔｏｒｆｏｒＥｎｄｏｓｐｅｒｍ－ｓｐｅｃｉｉｃｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

两端各有一个多克隆位点，可以方便地进行启动子替换，用于研究不同启动子的功能。外，该载体在ｇ此Ｙ因ｐ基的５端含有多克隆位点，在３端含有ＥｏｃＲＩ和ＢｍＩ两个单一酶切位点，可以方便地在５端连接上目标基因，ｓ
组中含有发根农杆菌Ｋ９质粒中的ｒｌ因和外源ｇｐ基因；５９ＲｉｏＢ基Ｙ转基因不定根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光，表明构建的转基因载体ｐＩ３ＳＧＦＢＮ．５．Ｐ能实现ｇｐ基因的高效表达。该载体在ＣＭＶ３Ｓ启动子的Ｙａ５
ｒｓｅｃｒｔｉｓｅｅｔｄｂｕｒｓｅｃｃｏｃｐ．ｎｐｒｉｕａｌ，ｅｖｃｏａｒｅｌｐｅｃｏｉｇｓｔｓｔｏｅｃｎｅｐｏｅｎｗａｔｃｅｙｆｏｅｃｎｅｍｉｒｓｏｙＩａｔｃｌｙｔｅｔｒｒｉｓｄｌｒｈｃｍｕｔｌｌｎｎｉｔ５ｉｅａｂｈｎｆｈＭａｄ３ｏｅＣａＶ５ｒｍｏｅ，ｉｈａｌｗｓａｙｅｃａｇ５ｒｍｏｅｔｄｔｅｒｍｏｅｕｃｏｓＩｄｉｏ．ｔ３Ｓｐｏｔｒｗｈｃｌｏｓｘｈｎｅ３Ｓｐｏｔｒｏｓｕｙｏｒｏｔｒｎｔｎｎａｄｔｎｅｔｈｐｆｉｉ
研究报告
含ｇｙｐ植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不
定根中的高效表达
徐纪明，向太和
杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州３０３１０６

载体构建基本步骤

载体构建基本步骤
1. 选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2. 对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测(1% ,若检测结果正确，测序结果之后进行胶回收目的片段
3. 通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体(PMD-18T
4. 转化DH5a,根据载体抗性涂板37度过夜培养
5. 挑取阳性克隆进行PCR验证,PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6. 测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7. 对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8. 将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5a,涂板37 度过夜
9. 挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。

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NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建3

陈　英1,戴咏梅1,2,王义琴3,孙勇如3,黄敏仁1,王明庥1(1.国家林业局林木遗传与基因工程重点实验室(南京林业大学),江苏　南京　210037;2.上海市花卉育种中心,上海　200072;

3.中国科学院遗传与发育生物研究所,北京　100101)

摘　要:防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP2NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。关键词:防御素基因NP1;天麻抗真菌蛋白基因GAFP;双价抗病基因;表达载体中图分类号:S722.3;Q813 文献标识码:A 文章编号:

1000-2006(2005)06-0007-04

TheConstructionofTwoDisease2resistanceGeneNP1andGAFPVectorCHENYing1,DAIYong2mei1,2,WANGYi2qin3,SUNYong2ru3,HUANGMin2ren1,WANGMing2xiu1(1.TheKeyLaboratoryofForestTreeGeneticsandEngineeringStateForestryAdministration(NanjingForestryUniversity),

Nanjing210037,China;2.ShanghaiFlowerBreedingCentre,Shanghai200072,China;3.InstituteofGeneticsandDevelopmentBiology,CAS,Beijing100101,China)

Abstract:Defensinisresistanttomanykindsofvirus,bacteriumandfungusl.GastrodiaAn2tifungalProtein(GAFP)hastheresistantabilitytomorethantwentykindsoffungi.Theantidiseasemechanismsandspectrumofthetwogenesaredifferent.UsingDNAreconstruc2tionmethodavector(pBin35SGAFPNP1)thatcontainstwoantidiseasegenes:NP1andGAFPwereconstructed.Thentwodisease2resistancegenescouldbetransferredintothesameplantjustthroughonetimeoftransformationthatcanimprovethedisease2resistanta2bilityofthetransgenicplanttomorekindsofpathogens.Sotheproceedingofplantantidise2sebreedingcouldbeaccelerated.Keywords:DefensinNP1;Gastrodiaantifungalprotein(GAFP);Twoantidiseasegenes;Vectorconstruction

植物病害主要由真菌、细菌、病毒和线虫引起。传统的抗病育种方法主要是利用植物本身的抗病特性通过有性杂交进行新品种选育。但由于可利用的抗性资源少、费时、耗资较大,并且病原小种或环境的变化也会导致抗性退化,使育种效果往往不理想。而现代分子生物学和基因工程的迅速发展开辟了抗病育种的新途径。目前在植物抗病基因工程中常只转入单个抗病基因,但有时由于单基因表达强度不够,抗病效果不甚理想;或者这些基因可以强表达,但作用机制比较单一,只能控制某一病原或生理小种和株系,同时高选择压会增强病原的变异速度,大面积推广单一抗病品种可能会引起品种抗病性的快速丧失。因此提高转基因植物的广谱抗病性和持久性十分重要。而同时转入两个或两个以上的起协同作用的抗病基因是解决这一问题的有效途径[1],这一策略在培育抗病、抗虫等抗逆性转基因植物方面已

得到应用[2]。兔防御素是抗微生物谱最广的防御素(Defensin)之一,它的抗病机理特殊,微生物对其不易产生抗性,兔防御素基因已转入多种植物,在植物抗病育种中应用前景较为广泛[3]。天麻块茎中所含的天麻

—7—

　第29卷第6期2005年11月　南京林业大学学报(自然科学版)JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition)　Vol.29,No.6

Nov.,2005　

3收稿日期:2005-03-28 修回日期:2005-09-08

基金项目:上海市农业科技攻关项目(第4-4号);南京林业大学高学历引进人才资助项目作者简介:陈　英(1973-),女,讲师,博士。抗真菌蛋白(Gastrodiaantifungalprotien,GAFP)对多种真菌均有抑菌活性[4,5]。陈英等将GAFP基因转入烟草,表达的GAFP蛋白质有离体抑菌活性,说明该基因可通过遗传转化途径整合到高等植物基因组中,并得到有效的表达[6],在植物抗病基因工程方面具有巨大的应用潜力。笔者将兔防御素

NP1基因和天麻抗真菌蛋白GAFP构建在一个植物表达载体上,为植物抗病基因工程创造条件。

1　材料与方法1.1　供试材料(1)菌种和质粒　大肠杆菌(Escheriachiacoli)DH5α;质粒pBin35SNP21,pBin35SGAFP,

pDM3022Fu,pGEM27zf均由中国科学院遗传与发育生物研究所提供。(2)酶和试剂　各种限制性内切酶购自Biolab公司;T4DNA连接酶购自Gibco公司;去磷酸化酶

购自Promega公司;质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自北京鼎国生物工程公司;其他试剂均为Sigma和国产分析纯。

图1　双价抗病基因植物载体pBin35SGAFPNP1的构建路线Fig.1　Constructionoftwodiseaseresistancegenesvec2torpBin35SGAFPNP1

1.2　载体构建方法(1)质粒DNA的酶切和终止　酶切反应体系

为:质粒DNA约1μg,10×Buffer2μL,内切酶3unit(用量不超过反应总体积的1/10),无菌水补至20μL,37℃保温2～3h,75℃水浴中保温5～10min。(2)DNA片段末端碱基去磷酸化　为防止用

单酶切的载体片段进行自连,影响连接效率,在连接前需进行载体片段去磷酸化。酶切产物中加入1μL的CIAP和一定体积EDTA(pH8.0),37℃保温30min,75℃水浴中保温5～10min。(3)目的片段和载体连接　将回收的目的片段

和载体按适当比例混合,加入1μL10×Buffer,

1μL的T4DNA连接酶,补双蒸水至10μL,混匀,22℃保温3h或4℃过夜。(4)重组克隆的筛选　将酶连产物转化大肠杆

菌感受态菌,涂布于含有相应抗生素的LB培养基上,37℃培养12～16h。随机挑选单克隆扩大培养,提取质粒,用相应的酶进行酶切鉴定。(5)载体构建路线　由于两个抗病基因均构建

在载体pBin19上,因此两个质粒具有相同的酶切位点。此外,GAFP基因中含有EcoRI位点,这些都不利于载体构建。因而在设计构建路线(图1

)

时必须通过中间载体进行酶切位点的调换,才能将两个基因构建在一个表达载体上。

2　结果与分析2.1　pDM3022FU235SNP1和pGEM235SNP1b的构建pBin35SNP1用HindⅢ和EcoRI酶切,回收1.3kb片段,包含35S启动子(0.8kb),NP1(0.2kb)和Nos终止子(0.3kb)。同时,将pDM3022FU用HindⅢ和EcoRI酶切,回收约2.8kb的载体片段,两者连接,转入大肠杆菌,随机挑取转化子培养,提取质粒,同样用HindⅢ和EcoRI酶切,重组子切下两个分别为1.3和2.8kb大小的片段(图2),说明pDM3022FU235SNP1已构建完成。将pDM3022FU235SNP1用XhoI和EcoRI双酶切,切下约1.3kb的片段,并回收该片段。同时用—8—

南京林业大学学报(自然科学版) 第29卷　第6期　XhoI和EcoRI双酶切pGEM27zf,成线型,两者连接,通过白斑筛选转化子。随机挑选1个蓝斑和7个白斑,摇菌并提取质粒,电泳检测结果显示:白斑质粒因外源基因的插入分子量较蓝斑质粒大,电泳速度较慢。同时将pGEM235SNP1b进行XhoI和EcoRI双酶切,切下约1.3kb的片段(图3)。图3说明pGEM235SNP1b已构建完成。

2.2　双价抗病基因载体pBin35SGAFP-NP1的构建图4　pBin35SGAFP-NP1酶切检测Fig.4　Restric2digestionidentificationofpBin35SGAFP2NP1　(1.pBin35SGAFP2NP1进行HindⅢ酶切;2,3.pBin35SGAFP

　质粒;4.pBin35SGAFP-NP1质粒;M.Marker

)

将pGEM235SNP1b用HindⅢ单酶切切下1.3kb的片段,回收。pBin35SGAFP用HindⅢ进行单酶切可把质粒切成线型,去磷酸化。二者连接,

转入大肠杆菌,随机挑取转化子培养,提取质粒,并进行HindⅢ酶切鉴定,切下了1.3kb的片段,说明双价抗病基因载体pBin35SGAFP-NP1已构建完成(图4)。

3　讨　论将多个基因构建在不同的表达载体上依次或同时转入同一受体,不仅耗时费力,而且得到多基因的效率也会随着载体数的增加而大幅度下降[7～9]。如将目的基因构建在同一个表达载体上,多基因表达载体构建完成后,只需通过一次转化就可方便而成功地获得多价基因同时表达的转基因植物[10]。因此,多基因载体的构建和遗传转化的研究日渐增多。目前已构建好了多价抗虫基因表达载体Bt+CpTI

[11],Bt+GNA[12]

,多价抗病表达载体RC24+

RAC22+RCH10[13],Glu+CHI[14],并且通过一次转化获得了转多价基因植物。防御素是一类氨基酸少于100的低分子短肽,广泛分布于动植物和昆虫体内,它是在病原体诱导下,生物有机体自身的防御系统产生的一系列拮抗物质,能竞争夺去微生物所必需的营养物质或破坏微生物的结构,从而阻止病害的传播和病原物的进一步侵害。防御素的抗病机理特殊,微生物不易对其产生抗性,并且防御素的抗菌谱广泛,对革兰氏阴性菌、阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用。所以与其他抗微生物肽相比,防御素具有更广泛的抗性,尤其是NPl和NP2,