重组胶原蛋白与牛源_型胶原蛋白红外光谱研究

３ 讨论
红外光谱是研究生物高分子结构和多肽链构型的有效 手段。天然胶原蛋白的三级结构呈独有的右手三螺旋构型， 由 ３ 个 Ｌ－ ＰＰⅡ 亚基相互缠绕而成， 每个亚基的三肽重复序
列 Ｇｌｙ－ Ｘａａ－ Ｙａａ 的 ＮＧ－ ＨＧ 与 相 邻 亚 基 的 ＣＸ＝ＯＸ 间 形 成 １ 个直接氢键， 其余 ２ 个 Ｃ＝Ｏ 以及羟脯氨酸的 ＯＨ 基团参与 分子内或分子间的水桥氢键。因此， 胶原蛋白红外光谱的酰 胺 Ａ、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ具有明显特征［８， １５， １６］。
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ， ＦＴ－ ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ＦＥ－ ＳＥＭ
天然胶原蛋白是具有独特三螺旋结构的纤维蛋白， 广泛 存 在 于 脊 椎 动 物 的 骨 骼 、肌 腱 、皮 肤 、血 管 以 及 基 质 膜 等 组 织 中， 是细胞外基质的主要成分。迄今为止， 已鉴别出 ２７ 种胶 原蛋白遗传型和 ４２ 种不同的胶原蛋白亚基以 及 １５ 种 类 胶 原蛋白结构域［１］。胶原蛋白分子由 ３ 个相同或不同的亚基组 成， 每个亚基都呈聚脯氨酸Ⅱ螺 旋 构 形（ Ｌ－ ＰＰⅡ） ， ３ 个 亚 基 又 相 互 缠 绕 成 右 手 超 螺 旋 结 构 。胶 原 分 子 的 亚 基 具 有 独 特 的 Ｇｌｙ－ Ｘａａ－ Ｙａａ 三 肽 重 复 序 列 ， 其 中 Ｘａａ 位 点 多 为 脯 氨 酸 （ Ｐｒｏ） 残基， Ｙａａ 位点多为羟脯氨酸（ Ｈｙｐ） 残基。最小氨基酸 甘氨酸（ Ｇｌｙ） 残基在胶原分子亚基中每第三个位点的重复出 现是胶原分子形成三螺旋结构的必要条件。天然胶原蛋白分 子内 ３ 个亚基间的直接氢键 （ Ｇｌｙ Ｎ－ Ｈ 与相邻亚基 Ｘａａ Ｃ＝Ｏ 之间） 以及亚基间的水桥氢键是维持三螺旋结构稳定的主要因 素， 另外 Ｙａａ 位点的羟脯氨酸也有助于三螺旋结构的稳定［２，３］。 胶原蛋白特有的结构和化学组成使其在生物医学和组织工 程领域得到了广泛应用， 如止血海绵、人造皮肤、软组织填充
１ 实验材料和方法
１．１ 胶原蛋白
重组胶原蛋白（ ＲＨＣｇ） ： 通过 ＤＮＡ 重 组 技术 ， 将 人 胶 原 的 ｍＲＮＡ 逆转录成 ｃＤＮＡ， 经酶切、修饰、重组， 由大肠杆 菌 （ Ｅ．ｃｏｌｉ） 表达、纯化 制 得 ， 分 子 量约 为 ７０ ｋＤａ， 理 论 肽 链 长 度 为 １０４９ 个氨基酸残基。
１４４４ １４５３
１３７８ １３８２ １３４０ １３３８ １２４０ １２３７
１０２４ １０３２
指认
酰胺 Ａ 酰胺 Ｂ ｖａｓ（ ＣＨ２） ｖｓ（ ＣＨ２）
酰胺 Ⅰ
酰胺 Ⅱ &（ ＣＨ３） ， ’ａｓ（ ＣＨ２） ，
!（ Ｃ－ Ｎ） (（ ＣＨ３） )ｗ（ ＣＨ２） 酰胺 Ⅲ !（ Ｃ－Ｏ） ， 丝氨酸侧 基 Ｃ－Ｏ 伸缩振动
表 １ 重组胶原蛋白和牛源Ⅰ型胶原蛋白红外谱峰指认 Ｔａｂｌｅ １ ＦＴ－ ＩＲ ｂａｎｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ＲＨＣｇ ａｎｄ ＢＴＣｇ
波数 ／ｃｍ－ １
红外
ＲＨＣｇ ＢＴＣｇ
３２９９ ３３２６
３０９４ ３０８１
２６６０
１５５０ １５５０
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ （ＲＨＣｇ） ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｎｄｏｎ ｔｙｐｅⅠｃｏｌｌａｇｅｎ （ ＢＴＣｇ） ａｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＦＴ－ ＩＲ ａｎｄ ＦＥ － ＳＥＭ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＦＴ － ＩＲ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ＲＨＣｇ ｄｉｆｆｅｒｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ＢＴＣｇ． ＦＴ－ ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｓｈｏｗｓ ａ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ－ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ａｎｄ ａ ｔｙｐｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｃｏｎｆｏｒｍａ－ ｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ． Ｔｈｅ ＲＨＣｇ ｓｈｏｗｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｆｒａｒｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ ｃｅｎｔｅｒｅｄ ａｔ １０２４ ｃｍ － １ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃ － Ｏ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒｓ ａｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＦＥ－ ＳＥＭ ｆｏｒ ｔｈｅ ＢＴＣｇ， ｂｕｔ ｉｔ ｉｓ ｎｏｔ ｔｒｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＨＣｇ． Ｉｔ’ｓ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＨＣｇ ｄｉｆｆｅｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＢＴＣｇ ｉｎ ｂｏｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｍａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｅｗ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｉｌｏｒ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎ－ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ．
文献
［ ８， ９］ ＊ ［ １０］ ， ［ ９］ ＊ ［ １０～１２］ ＊＊， ［ ６， １３］ ＊
［ １０］ ［ １０］ ， ［ １２， １４］ ＊＊，
［ ８， ９， １５］ ＊ ［ ８］ ＊
［ １１， １２， １４］ ＊＊， ［ ９， １３］ ＊
［ １１］ ＊＊， ［ ９， １３］ ＊ ［ １０］ ， ［ １４］ ＊＊
在 双 键 区（ ２０００～１５００ ｃｍ－ １） ， 重 组 胶 原 蛋 白 的 酰 胺 Ⅰ 谱 带 出 现 ２ 个 峰 （ １６５１、１６３２ ｃｍ－ １） ， 且 １６３２ ｃｍ－ １ 峰 强 于 １６５１ ｃｍ－ １ 峰， 这是由两种缔合了氢键的 Ｃ＝Ｏ 基团的振动引 起的。酰胺Ⅰ谱带通常不受肽链侧基影响， 振动频率取决于肽 链构型， 对三螺旋结构的变化非常敏感。此双峰的出现也表明 重组胶原蛋白不具备三螺旋结构特征， 很有可能为聚脯氨酸 Ⅱ 螺旋的类片层聚集结构［８］。牛源胶原蛋白的酰胺Ⅰ谱带只出 现 １ 个峰（ １６６０ ｃｍ－ １） ， 这与胶原蛋白三螺旋结构的红外光谱 特征相符［１５］。两种胶原蛋白的酰胺Ⅱ峰相同（ １５５０ ｃｍ－ １） 。酰 胺Ⅱ谱带主要是由异相 Ｎ－ Ｈ 面内弯曲振动和 Ｃ－ Ｎ（ 具有双 键性质） 伸缩振动共同产生的。与酰胺Ⅰ谱带相同， 酰胺Ⅱ谱 带也不易受肽链侧基影响， 但对胶原蛋白的三螺旋结构不敏 感 ［８］ 。
在氢键区 （ ４０００～２５００ ｃｍ－ １） ， 两种胶原蛋白各出现 ３ 个峰， 分别为酰胺 Ａ、酰胺 Ｂ 以及亚甲基的反对称面内弯曲 振动。胶原蛋白的酰胺 Ａ 谱带主要是由 Ｎ－ Ｈ 的伸缩振动引 起的， 酰胺 Ｂ 谱带是由酰胺 Ａ 与酰胺Ⅱ的一次泛频耦合的 结果（ 费米共振） 。其中酰胺 Ａ 对胶原蛋白三螺旋结构很敏 感。胶原蛋白的酰胺 Ａ 谱带（ ３３２５～３３３０ ｃｍ－ １） 比变性胶原 蛋白和聚脯氨酸Ⅱ伸展链的峰频 （ ～３３００ ｃｍ－ １） 高 ２５ ｃｍ－ １ 以上［８］。重组胶原蛋白的酰胺 Ａ 峰频为 ３２９９ ｃｍ－ １， 比牛源胶 原蛋白低 ２７ ｃｍ－ １， 与变性胶原蛋白和聚脯氨酸Ⅱ的酰胺 Ａ （ ～３３００ ｃｍ－ １） 接 近 ， 表 明 重 组 胶 原 蛋 白的 酰 胺 Ａ 不 具 有 三 螺旋构型特征。
注射液、组织工程支架以及药物缓释载体［ ４～６］ 。目前医学临床 和组织工程使用的胶原蛋白主要源自动物组织和基因重组 表达。然而， 重组胶原蛋白与天然胶原蛋白的生物合成机制 不同［７］， 这势必导致两种胶原蛋白在结构和功能 方 面 存 在差 异。为了认识重组胶原蛋白和牛源Ⅰ型胶原蛋白结构的异 同， 我们用红外光谱和场发射扫描电子显微镜对重组胶原蛋 白和牛源Ⅰ型胶原蛋白进行了比较研究。
材料导报
２００８ 年 ３ 月第 ２２ 卷第 ３ 期
介于 ９５～１００ ｋＤａ 之间。
１．２ 分析方法
红外光谱分析： 采用 ＥＱＵＩＮＯＸ ５５／ＨＹＰＥＲＯＮ ２０００ 红 外 光谱 仪（ 德 国 布 鲁 克 光 谱 仪器 公 司） ， ＤＴＧＳ 检 测 器 ， 分 辨 率 ４ ｃｍ－ １。ＢＴＣｇ 和 ＲＨＣｇ 分别溶于 ｐＨ ４．３ 的柠檬酸缓冲液 中， 配制成浓度为 ５ｍｇ／ｍＬ 的溶液。溶解后的胶原样品放入 透析袋中， 在 ５℃ 用重蒸水透析 ３ 天。透析后的两种胶原蛋 白溶液各 ２５ !Ｌ 滴到 ＣａＦ２ 红外窗片上制成均匀薄膜， 放入 盛有 Ｐ２Ｏ５ 的 干 燥 器 中 备 用 。使 用 ６４ 次 扫 描 ， 记 录 ４０００ ￣ ４００ｃｍ－ １ 区间的背景光谱。
（ １ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｔｏｎｇｊｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９２； ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６０３４； ３ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｑｉｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１１０６）
摘要 用红外光谱分析了重组胶原蛋白和牛源Ⅰ型胶原蛋白的结构， 并用场发射扫描电镜观察了两种胶原蛋白 的形貌。结果表明， 两种胶原蛋白的红外光谱存在显著差异，牛源Ⅰ型胶原蛋白的红外光谱呈典型的三螺旋结构特征， 而重组胶原蛋白的红外光谱呈变性胶原蛋白特征； 重组胶原蛋白的红外光谱在 １０２４ ｃｍ－１ 附近有很强的丝氨酸侧基 Ｃ－ Ｏ 伸缩振动吸收峰； 牛源Ⅰ型胶原蛋白分子形成胶原纤维， 重组胶原蛋白没有纤维存在， 重组胶原蛋白与牛源Ⅰ型胶原 蛋白的分子构型和聚集结构不同。研究结果将为胶原基生物医学材料和组织工程支架的设计使用提供理论依据。
关键词 胶原蛋白 傅立叶变换红外光谱 场发射扫描电镜