超声波破碎高效液相色谱法定量检测核酸
高效液相色谱法
答：气相温度对于样品的气化程度影响很大,一般来说温度越高,气化越快,通过色谱柱时间也越短,气相单一物质分析一般用恒温,多种物质分析时,通过改变柱温能够很好的对样品进行分离,节省了分析时间,这时往往用梯度升温。
3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
答：能，浓度对峰面积更优越。因为有些峰不完全对称，用它作标准曲线误差较大。
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
答： 干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
液相并不是都是室温,一般来说,温度对于反相色谱分析影响不大,所以用反相柱分析时,一般用室温,不配备柱温箱,但是很多正相色谱分析时对于温度要求比较严格,比如说配位体交换色谱法时,温度的影响还是很大的。
5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、10μL平头微量注射器。
四、实验内容
1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、80、160μg·mL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，4mL，8mL稀释为50mL）
2、谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：4μL；柱温：室温。
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
核酸定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸定量中的应用。
3. 提高实验操作技能，培养科学思维和实验数据分析能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内重要的生物大分子，其含量与生物体的生命活动密切相关。
核酸定量测定是生物学、医学和分子生物学等领域的重要研究手段。
1. 紫外分光光度法：核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
DNA和RNA在260 nm波长处的紫外吸收峰较强，可用于定量测定核酸含量。
2. 定磷法：核酸分子中含有一定比例的磷，DNA和RNA的含磷量分别为9.2%和9.0%。
通过测定核酸中磷的含量，可间接计算出核酸的量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：粗核酸、DNA标准品、RNA标准品、样品待测液、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、试管、吸管等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸标准溶液：准确称取一定量的DNA和RNA标准品，用蒸馏水配制成一定浓度的标准溶液。
（2）测定样品核酸含量：将样品待测液稀释至一定浓度，取适量样品溶液，在260 nm波长处测定其吸光度。
（3）绘制标准曲线：以DNA或RNA标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的核酸浓度，计算样品中核酸的量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制标准磷溶液：准确称取一定量的磷酸二氢钾，用蒸馏水配制成一定浓度的标准磷溶液。
（2）测定样品核酸中磷含量：将样品待测液加入强酸，使核酸分子中的有机磷转化为无机磷，与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
在还原剂存在下，磷钼酸铵被还原生成钼蓝，用分光光度法测定其在660 nm处的吸光度。
（3）绘制标准曲线：以标准磷溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷浓度，乘以核酸的含磷量，计算样品中核酸的量。
反相高效液相色潽法RP
RP-HPLC的特点和优势
特点
RP-HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点。该方法能够分离复杂样品中的微量组分，特别适合于分 离和分析生物样品和环境样品中的有机小分子。
优势
RP-HPLC的流动相选择范围广泛，可以根据不同样品的性质选择合适的流动相，提高分离效果。此外，RPHPLC使用的固定相种类也较多，可以根据分离需求进行选择。该方法操作简便，易于自动化，可广泛应用于科 研和工业生产中。
有机污染物分析
RP-HPLC可用于检测水体、土壤等环境中的有机 污染物，评估环境质量。
工业废水处理监测
通过RP-HPLC，可以监测工业废水处理过程中有 害物质的去除效果。
化工产品分析
RP-HPLC可用于分析化工产品中的组分和含量， 控制产品质量和生产过程。
THANK YOU
提高了分离性能和选择性。
应用领域
RP-HPLC广泛应用于药物分析、生化研究、环境监测、食品安全等领域。在药物分析 中，RP-HPLC用于药物的分离、纯化和质量控制。在生化研究中，RP-HPLC用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和检测。在环境和食品安全领域，RP-HPLC用于检测和
监测各种污染物和有害物质。
原理
在RP-HPLC中，样品在非极性固定相和极性流动相之间的分配作用实现分离。 组分在固定相和流动相之间的溶解度差异导致不同的迁移速度，从而实现分离。
发展历程和应用领域
发展历程
RP-HPLC起源于20世纪60年代，随着高效液相色谱技术的发展而逐步完善。早期的 RP-HPLC使用硅胶作为固定相，后来逐渐发展为使用有机聚合物和混合模式固定相，
等领域。
电化学检测器
通过电化学方法对待测组分进 行氧化还原反应，从而进行检
核酸的定量分析方法
其他比值法
总结词
除了染料法和酶法之外，还有一些其他的比值法用于 核酸的定量分析。
详细描述
这些方法包括荧光定量PCR法、基因芯片法、数字 PCR法等。荧光定量PCR法是一种实时定量PCR技术 ，通过在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的 积累与核酸浓度之间的线性关系来实现对核酸的定量 分析
06
基于荧光染料的方法
。
优点
简单易行，对样品预处理要求 较低，定量准确度高。
荧光光谱法
原理
荧光光谱法是通过特定波长的激发光激发核酸分子中的荧光基团，产生荧光信号，通过测量荧光信号的强度，对核酸进行定 量分析。
应用范围
该方法主要应用于低浓度核酸样品的定量分析，如基因芯片、蛋白质芯片等。
优点
灵敏度高，可实现多通道检测，特异性较强。
应用
核酸质谱法在基因突变筛查、基因表达差异分析、基因测序 等方面有广泛的应用。
基质辅助激光解吸/电离质谱
原理
基质辅助激光解吸/电离质谱是一种将样品固定在某种基质上，再用激光束照 射，使样品瞬间气化并离子化的方法。
应用
基质辅助激光解吸/电离质谱在蛋白质组学、代谢组学、生物医药等领域有广 泛的应用。
同位素标记法
原子光谱法
01
02
03
原理
原子光谱法是通过原子能 级跃迁时吸收或发射特定 波长的光，对核酸中的元 素进行定量分析。
应用范围
该方法主要应用于分析核 酸中的元素种类和含量， 如P、S等。
优点
可同时检测多种元素，灵 敏度高，精密度高。
04
基于质谱的方法
核酸质谱法
原理
核酸质谱法利用质谱技术，将核酸分子离子化并分离出不同 质量的离子，从而实现对核酸的定量分析。
核酸的定量分析方法
将样品放入核磁共振谱仪中，通过调节磁场强度和射频 脉冲的频率和幅度，获取样品的一维核磁共振谱图。
方法优缺点
优点是无需进行化学反应，对样品无损伤；缺点是对仪 器要求较高，谱图解析较为复杂。
THANK YOU.
在MALDI-TOF MS中，样品分子与基质分子混合 后，通过激光束照射基质分子，使样品分子离子 化并解吸进入气相。
MALDI-TOF MS具有高灵敏度、高分辨率和高通 量等优点，可广泛应用于蛋白质、核酸等生物分 子的分析鉴定，如用于蛋白质组学研究、DNA测 序和定量分析等。
06
基于核磁共振的定量分析方 法
核磁共振的基本原理
01
核磁共振现象
原子核在磁场中进行旋转，当磁场发生变化时，原子核吸收能量并发
生跃迁，产生核磁共振信号。
02
原子核自旋
原子核具有自旋角动量，在外加磁场中会产生磁矩，导致原子核在磁
场中进行旋转。
03
核磁共振条件
原子核只有在磁场发生变化时才会发生核磁共振，变化的磁场可以是
静磁场或梯度磁场。
02
基于染料结合的方 法
该方法利用荧光染料或溴化乙锭等 染料与DNA结合形成复合物，通过 测量染料-DNA复合物的荧光信号 强度来定量核酸。该方法包括荧光 染料结合法和荧光光谱法等。
基于标准品比较的 方法
该方法通过与已知浓度的标准品 进行比较，推算未知样品的浓度
04
基于生物传感器的 方法
该方法利用生物传感器对核酸进行 定性和定量分析
定量分析指导实验设计
通过对核酸进行定量分析，可以了解特定实验条件下细胞或 生物体内核酸的含量，指导实验设计、功能研究及临床诊断 等。
核酸定量分析的方法分类
核酸纯度鉴定的方法和原理
核酸纯度鉴定的方法和原理核酸纯度鉴定是在实验室中常用的核酸质量控制方法之一。
在进行分子生物学研究、基因克隆、PCR反应、基因测序等实验过程中，准确评估核酸的纯度是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
核酸纯度的鉴定方法主要包括比色法、比浊法、紫外吸收光谱法等。
其中，紫外吸收光谱法是最常见且最常用的一种方法。
紫外吸收光谱法是利用核酸在紫外光（200-300 nm）波长范围内的特征吸收来评估核酸的纯度。
纯的核酸在260 nm处有一个最大吸收峰，而蛋白质、有机物等可能存在的污染物则往往在280 nm处有吸收峰。
因此，通过测量核酸在260 nm 和280 nm处的吸光度比值（A260/A280），可以初步判断核酸的纯度。
一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A280比值应在1.8-2.0之间，而纯度良好的RNA样品则应在1.9-2.1之间。
除了A260/A280比值，还有一个常用的指标是A260/A230比值。
这个比值是衡量核酸样品中存在的有机物污染程度的指标。
在制备核酸样品时，常常会使用一些试剂，如酚/氯仿、异丙醇等，这些试剂残留在核酸样品中会导致A260/A230比值下降。
一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A230比值应在2.0-2.2之间，而纯度良好的RNA样品则应在2.0以上。
此外，可以通过琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等方法进一步鉴定核酸纯度。
这些方法可以更加精确地确定核酸样品中的杂质含量，并进一步评估核酸的质量。
综上所述，核酸纯度鉴定的方法主要包括紫外吸收光谱法，通过测量A260/A280和A260/A230比值来初步评估核酸的纯度。
此外，还可以采用其他分析方法，如凝胶电泳、高效液相色谱等，来进一步确定核酸纯度。
这些方法的应用可以确保实验结果的准确性，并为后续实验提供良好的实验基础。
核酸的定量测定.
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的 核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（ 地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜 绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光 吸收。
2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的核苷酸
离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的核苷酸离子交换高效液相色谱法（Ion Exchange High Performance Liquid Chromatography, IE-HPLC）是一种用来分析和测定离子样品中特定离子的方法。
在婴幼儿奶粉中，核苷酸是一种重要的生物化学成分，在生长和发育过程中起着重要的作用。
测定婴幼儿奶粉中的核苷酸含量，可以进一步了解其营养成分和品质。
以下是通过IE-HPLC测定婴幼儿奶粉中核苷酸的步骤和原理。
步骤：1. 样品制备：将婴幼儿奶粉样品称取适量，加入适量的水中，使用超声波处理或搅拌混匀，使其完全溶解。
2. 样品提取：将溶解的样品经过离心，取上清液备用。
3. 样品预处理：取适量的上清液经过固相萃取柱预处理，去除杂质和干扰物。
4. 色谱条件设置：使用离子交换色谱柱，常用的是阴离子交换柱（例如剑桥YI-WAX 柱），并设置适当的流动相。
5. 样品注射和分离：将处理好的样品溶液通过进样器注入色谱仪，然后在一定的流动相梯度条件下分离核苷酸。
6. 检测器选择：常用的检测器是紫外-可见分光光度计，选择合适的检测波长进行检测。
7. 数据处理：使用专业的色谱软件对数据进行峰面积积分或峰高测定，计算核苷酸的含量。
原理：IE-HPLC法基于核苷酸在阴离子交换柱上的亲和性，通过吸附/解吸机制实现分离和测定。
在阴离子交换柱上，核苷酸的负电荷可以与柱填料上的功能基团形成离子交换作用。
核苷酸分子上亲希尔基的负电荷与功能基团形成亲合作用，使核苷酸停留在阴离子交换柱上。
然后通过改变流动相的离子浓度、类型和pH值，使核苷酸解吸从而实现分离。
通过对核苷酸峰的峰面积或峰高进行定量分析，计算样品中核苷酸的含量。
离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的核苷酸是一种准确、灵敏和可靠的方法，可以为奶粉生产企业提供关于产品质量和营养成分的重要信息，保障婴幼儿的健康。
高效液相实验报告
篇一：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一、实验目的1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc分离测定来对目标化合物的分析鉴定。
二、实验原理液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。
当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。
液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。
高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。
80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。
三、高效液相色谱的分类吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法四、高效液相色谱仪的基本构造高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。
1 输液系统：包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。
贮液装置用于存贮足够量、符合hplc要求的流动相。
高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。
2 进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。
液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。
进样系统包括取样、进样两项功能。
3 分离柱：色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。
商品化的hplc微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
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DOI：10．3724/SP．J．1096．2011．01442超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸
董莲华*盛灵慧王晶黎朋（中国计量科学研究院，北京100013）
摘要采用超声波破碎结合高效液相色谱技术，建立了定量检测质粒DNA的方法，测量结果可以溯源至核苷酸标准物质。采用超声波破碎（功率300W，频率24kHz）技术将质粒DNA破碎成200～500bp的小片段DNA，再用蛇毒磷酸二酯酶将其水解为4种核苷酸（dCMP：3．2min；dTMP：4．7min；dGMP：5．3min，dAMP：6．8min），将产物通过HPLC分离后，采用外标法进行定量分析。应用此方法对待测质粒pNK603进行定量分
析，测定的4种核苷酸的摩尔百分比（A∶T=0．95，C∶G=0．98）与理论值接近。本方法的测定结果（47．24!g/g）与实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR，45．98!g/g）和PicoGreen荧光染料法（46．02!g/g）的测定结果
没有显著差异，表明建立的超声波-HPLC方法可以应用于质粒DNA的定量分析。
关键词质粒；超声波破碎；高效液相色谱；荧光；聚合酶链式反应
2011-01-04收稿；2011-04-15接受
本文系科技支撑项目（No．2008BAK41B01）和博士科研专项基金（No．ATQDB0908）资助*E-mail：lianhuadong@gmail．com
1引言
核酸是生物遗传信息的载体，对核酸的定量分析是解析核酸结构和功能的基础。目前定量分析核酸的方法根据其原理的不同分为两类：一类是直接定量检测核酸，主要是通过应用标记探针的杂交反应进行定量检测；另一类是将待测核酸扩增后，再通过酶免疫法（EIA）、发光分析、荧光分析等方法定量检测扩增产物，主要是定量聚合酶链式反应（PCR）技术。在应用上述方法测定核酸含量时，其测量结果的溯源性、可比性还未引起关注。但是，在核酸标准物质制备过程中（如质粒分子标准物质），其核酸测量溯源的重要性就凸显出来。为了解决核酸定量测量的准确、溯源问题，各国都在进行探索。本研究试图通过色谱或质谱技术建立一个可溯源的高准确度的测量方法，即将双链的基因组或质粒核酸水解成单核苷酸，通过同位素稀释质谱法测定水解后的核苷酸的含量，据此计算核酸的浓度；还可根据核酸序列信息及4种核苷酸的摩尔浓度检查核酸水解是否完全。应用这种方法测定的结果可以溯源到核苷酸标准品，从而解决核酸测量的溯源问题。目前，应用同位素稀释质谱测定寡核苷酸（20mer）浓度的方法已经比较成熟［1］，但是对于双链，且
长度大于几百个碱基对的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR和荧光染料法外，由于缺乏相应的标准品，还没有其它成功的方法可用。长片段核酸无法直接完全酶解，因此，建立一个可以将长片段核酸碎裂为小片段核酸进而可以完全水解的方法，是实现大片段核酸的色谱、质谱及毛细管电泳定量分析的关键。本实验的目的是以质粒DNA为分析对象，利用超声波破碎技术将其破碎成小片段DNA，通过优化条件使其破碎后的产物可以进行完全酶解，酶解产物利用高效液相色谱（HPLC）进行定
量分析，以期建立一个溯源链清晰，准确度高的核酸定量测量方法。
2实验部分
2．1仪器与试剂
1200液相色谱仪（安捷伦中国有限公司）；酶标仪（M200，TECAN）、荧光定量PCR仪（AB7900HT，美国ABI公司）；JY92ⅡD超声波破碎仪（南京新辰公司）。TaqmanUniversalMasterMix试剂盒（4304437，美国ABI公司）；SB-AQ色谱柱（150mm×4．6mm，安捷伦中国有限公司）；特异性引物和探针
（上海英俊公司合成），其中探针5'端采用荧光标记基团FAM进行标记，3'端采用荧光猝灭基团TAMRA
第39卷2011年9月分析化学（FENXIHUAXUE）研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemistry第9期1442～1446进行标记。具体序列见表1。乙腈（色谱纯）、蛇毒磷酸二酯酶（SVP）、4种核苷酸标准品，均购自美国Sigma公司。
表1NK603特异性序列和内源基因扩增引物和探针Table1PrimersandprobesforGM（geneticmodified）maizeNK603eventspecificgeneandendogenousgene
目标序列Targetgene定性/定量扩增Qualitative/quantitativeamplification引物/探针名称Primer/probe引物序列（5'-3'）Sequence（5'-3'）产物大小Product（bp）
zSSIIb定量PCR扩增QuantitativePCRzSSIIb-2F1-5'CTCCCAATCCTTTGACATCTGCzSSIIb-2R1-3＇TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGGzSSIIb-PFAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA151
［2］
NK603定量PCR扩增QuantitativePCRNK603-2F5'-ATGAATGACCTCGAGTAAG（T）CTTGTTAA-3'NK603-2R5'-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3'NK603-PFAM-TGGTACCACGCGACAGACTTCCACTC-TAMRA108
［3］
2．2实验方法
2．2．1超声波处理及酶解取2mL质粒pNK603DNA进行超声处理，重复7次。处理条件：功率
300W，频率24kHz，超声4s，间歇4s。工作时间50min。取超声波处理后的DNA样品60!L，加入8!LSVP（5mg/L）和8!LSVP缓冲液，37℃酶解3h，85℃酶解20min。设置3个平行，分别以不加SVP和不加DNA样品为酶解样品的对照。同时将未经
超声波处理的质粒DNA直接进行酶解作为超声波处理样品的对照。2．2．2HPLC分析将酶解后的样品经12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分
析。流动相A：20mmol/L醋酸铵（pH3．5）；流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～5min，100%A；5～10min，90%A；10～20min：90%A；20～25min：100%A。流速：1mL/mim，进样量20!L。检测波长254nm。2．2．3荧光定量PCR扩增及定量标准曲线的制作为了与HPLC方法测定质粒浓度结果进行比较，将相同的质粒DNA样品进行荧光定量PCR扩增，测定其浓度。采用表1中的引物和优化的扩增体系［4］进行PCR扩增。扩增条件：95℃，5min；45个循环：95℃，15s；60℃，1min。标准曲线的制作：将质粒DNA用荧光染料法测定浓度后，梯度稀释成5个标准溶液，采用上述条件和体系进行扩增，以初始质粒标准溶液浓度的对数为横坐标，以扩增得到的Ct值为纵坐标作图。
图1超声波处理质粒pNK603结果（1～7泳道分别为超声处理10min，15min，20min，marker，30min，50min，未处理质粒）Fig．1ElectrophoresesresultofplasmidpNK603treatedbyultrasonic（lane1to7areultrasonictreatmentfor10min，15min，20min，marker，30min，50minanduntreatedpNK603）
拷贝数（L）与质量浓度（C）换算公式：L=CDNA×6．02×1023/（3301×660）其中，CDNA为质粒浓度（g/L）；3301为质粒分子的碱基对个数；660为每个碱基对的平均分子量。2．2．4荧光染料法测定质粒DNA浓度采用PicoGreen试剂盒法对待测质粒DNA样品进行浓度测定，具体方法见PicoGreen操作说明书。
3结果与讨论
3．1质粒DNA的超声波破碎
将质粒DNA进行超声波破碎处理后，采用2．5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。第7泳道为未经处理的质粒，1～6泳道依次为超声处理10min，15min，20min，marker，30min和50min。由此可见，超声波处理50min后，质粒pNK603由原来的3．4kbp破碎成了主带在200～500bp的DNA片段。增加超声波处理功率，破碎结果没有
明显差异。另外，通过胶回收测定超声波破碎效率，发现超声波破碎质粒DNA的最佳浓度为30～90!g/g；浓度大于200!g/g，破碎的效率降至50%。
3441第9期董莲华等：超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸3．2酶解及HPLC分离
将超声破碎后的DNA片段进行酶解，酶解后的产物经HPLC分离，分离结果见图2。图2a为4种核苷酸标准品的分离结果，根据出峰先后顺序，4个峰分别为dCMP（3．2min），dTMP（4．7min），dGMP（5．3min）和dAMP（6．8min）。图2b为质粒DNA破碎、酶解后产物的分离结果。质粒DNA经过超声波破碎和
图2核苷酸标准品及质粒pNK603水解产物的HPLC分离结果Fig．2SeparationofstandardnucleotidesandhydrolyzedproductsofpNK603byHPLC（a）．4种核苷酸标准品分离结果；（b）．超声波破碎处理质粒pNK603水解产物
分离结果；（c）．未经超声波处理质粒水解产物分离结果。（a）．separationofstandardnucleotides；（b）．hydrolyzedproductsofultrasonictreatedplasmidpNK603；（c）．hydrolyzedproductsofplasmidpNK603withoutultrasonictreat；theabscissaisretentiontime：min）
酶解后的产物为4种核苷酸，且4种核苷酸在该实验条件下得到了理想的分离效果。图2c为没有经过超声波处理的质粒直接酶解后的产物分离结果，该结果与超声波处理后进行酶解的质粒DNA水解结果不同，未有发现dTMP对应的吸收峰，而在保留时间为12．9，18．7和22．2min处出现了新的吸收峰，这表明
未经过超声波处理的质粒DNA直接进行酶解，没有完全水解。因此，超声波处理对质粒DNA的完全水解起关键作用，而质粒是否完全水解直接影响质粒DNA浓度的测定结果。3．3HPLC定量分析核苷酸
采用面积归一化法对超声处理的质粒DNA进行定量分析，4种核苷酸的标准曲线方程和线性相关系数见表2。4种核苷酸的标准曲线线性相关系数均
大于0．99，可见4种核苷酸的浓度与其峰面积的线性相关性很好。根据标准曲线产生的标准方程对质粒DNA水解后的4种核苷酸进行定量分析。4种核苷酸的质量浓度之和，即待测质粒的浓度（47．24!g/g）。测定的摩尔百分含量值与理论摩尔百分含量值非常接近。另外，根据测定结果计算出的A：T（0．95）和C：G（0．98）的值与理论值1也很接近。表2质粒pNK603的HPLC定量结果Table2ResultofplasmidpNK603quantificationbyHPLC