MCF-7细胞原位电化学检测方法研究

ＨＥＩＬＯＮＧＪＩＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ　Ｆｅｂ．２０１４，Ｖｏ１．３７　Ｎｏ．１　・９１・　ＭＣＦ一７细胞原位电化学检测方法研究　程冠华，张树萌，陈年丰，武冬梅　（佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯１５４００７）　

摘要：目的：电化学法检测原位收集获得的ＭＣＦ一７细胞电化学信号，建立操作简单，快速、敏感、价廉、细胞用量少的原位　细胞电化学检测方法。方法：采用循环伏安法研究原位细胞收集法对电化学信号的影响。结果：采用电化学法检测原位收集获　得的ＭＣＦ一７细胞质，其电化学信号高于传统收集的细胞质电化学信号。结论：原位细胞收集缩短了检测前细胞处理的准备过　程，提高了细胞电化学响应强度。　关键词：原位细胞电化学；循环伏安；ＭＣＦ一７　中图分类号：Ｒ９６５．２文献标识码：Ａ文章编号：１０Ｏ８—０１０４（２０１４）０１—００９１一Ｏ２　肿瘤是一种严重影响和威胁人类生存健康和生活质量　２　结果与讨论　的重大疾病口　。筛选和寻找毒副作用小，药理作用独特，且　２．１　原位电化学法检测ＭＣＦ－－７细胞质的电化学行为　材料易于获取的新型抗肿瘤药物，是药学工作者的一个重要　任务。目前常用的抗肿瘤药物筛选的筛选技术有双杂交技　术、基因工程技术、ＭＴＴ比色分析法等【７　，但这些方法具　有检测周期长，有毒等缺点。因此建立一种简单、快速、无标　记的抗肿瘤药物筛选系统或者方法已成为当前该领域亟待　解决首要问题　本文以人乳腺肿瘤细胞（ＭＣＦ一７）为模型，采　用循环伏安法探讨了原位收集细胞的电化学行为，为原位细　胞电化学检测方法在抗肿瘤药物及其具有抗肿瘤活性的先　导化合物体外快速筛选上的应用提供实验和理论依据。　１　实验部分　１．１　试剂与仪器　ＬＫ２００５恒电位仪，天津市兰力科化学电子高技术有限　公司；ＨＨＣＰ—Ｔ型二氧化碳培养箱，上海一恒科学仪器有限　公司；人乳腺肿瘤细胞ＭＣＦ一７，东北林业大学赠送；优级胎　牛血清、ＤＭＥＭ培养基、双抗（链霉素和青霉素）为Ｇｉｂｅｏ公　司；多壁碳纳米管（ＭｗＮＴＳ），深圳纳米港有限公司；离子液　体（ｂｍｉｍ－－ＰＦ６）购于百灵威科技有限公司；其余试剂均为分　析纯　。　１．２　修饰电极的制备　

称取酸化处理完毕的多壁碳纳米管（ＭＷＮＴｓ）８０　ｍｇ，量　取离子液体（ＩＬ，［ＢＭＩＭ］ＰＦ６）１．６ｍＬ，在玛瑙研钵中将两者　研磨混合直至形成均匀黏稠的黑色胶体。玻碳工作电极　（ＧＣＥ）依次用１．０，０．５，０．Ｏ５　ｍ的氧化铝抛光，然后依次用　二次蒸馏水和无水乙醇超声洗净，室温晾干备用。取适量黑　色混合胶体通过刮涂法涂抹于ＧＣＥ表面，即得多壁碳纳米　管和离子液体复合修饰玻碳工作电极（ＭｗＮＴｓ—ＩＬ／ＧＣＥ）。　检测前置于ｐＨ　７．４ＰＢＳ溶液中，在０．０～＋１．０　Ｖ范围内循　环伏安法扫描至背景稳定，室温放置备用。　１．３　电化学测定系统　本实验采用三电极体系作为电化学测试系统，其中多壁　碳纳米管和离子液体复合修饰玻碳电极为工作电极　（ＭＷＮＴｓ—ＩＬ／ＧＣＥ），Ａｇ／ＡｇＣ１丝为参比电极，Ｐｔ丝为辅助　电极。　１．４　ＭＣＦ一７细胞的收集　传统细胞收集法：将生长状态良好且长满培养皿底的细　胞依次按０．２５％胰蛋白酶消化、吹打悬浮、离心　（１０００ｒ・ｒａｉｎ～，１０ｒａｉｎ）后得细胞沉淀，所得细胞沉淀用ｐＨ７．　４ＰＢＳ溶液冲洗３０：，然后用适量的ｐｉｔ７．４ＰＢＳ溶液配成细胞　悬液并计数。所得细胞悬液在水浴５０℃作用３０ｍｉｎ后进行常　规电化学测定。　原位细胞收集法：将生长状态良好且长满培养皿底的细　胞用ＰＢＳ清洗３次，加入适量的ｐＨ７．４ＰＢＳ在水浴５０℃作用　３０　ｒａｉｎ后即可进行常规电化学测定。　

见图１。　Ｅ，Ｖｖｓ．Ａｇ，Ａ　ｌ　图１　ＭＣＦ一７细胞质的伏安行为　（ａ）ｐＨ　７．４　ＰＢＳ，（ｂ）传统收集的ＭＣＦ一７细胞质，（ｃ）原位收集的　ＭｃＦ一７细胞质，细胞浓度３．０×１００　ｃｅｌｌｓ・ｍＬ一　对６０ｒａｍ培养皿中培养的ＭＣＦ一７细胞采用原位收集，　研究原位收集获得ＭＣＦ一７细胞的循环伏安行为，并与传统　的细胞收集法做了电化学行为比较研究。图１为原位收集的　ＭＣＦ一７细胞质和传统收集的ＭＣＦ一７细胞质的电化学行　为。两种收集方法均在０．６Ｖ左右和０．９Ｖ左右得到两个氧化　峰（Ｐｅａｋ　Ｉ和ＰｅａｋⅡ）。　２．２　不同细胞收集方法对峰电流的影响　见表１。　表１细胞收集方法对细胞峰电流的影响（　±　，ｎ＝３）　

不同的细胞收集法会对Ｉｐ值产生不同的影响，表１描述　了细胞收集方法对Ｉｐ值的影响，原位收集的ＭＣＦ一７细胞质　Ｐｅａｋ　Ｉ的Ｉｐ值为６ｏ．２８　Ａ，与传统收集ＭＣＦ一７细胞质　Ｐｅａｋ　Ｉ的Ｉｐ值相比较，原位收集的ＭＣＦ一７细胞质Ｐｅａｋ　Ｉ　Ｉｐ　值增长４．４７ｌ上Ａ，相对增长率为８．０％；原位收集的ＭＣＦ一７细　胞质ＰｅａｋⅡ的Ｉｐ值为８４．７３　Ａ，与传统ＭＣＦ～７细胞质　ＰｅａｋⅡ的Ｉｐ值相比较，原位收集的ＭＣＦ一７细胞质ＰｅａｋⅡ　的Ｉｐ值增长２．２７　Ａ，相对增长率为２．８　。原位收集细胞质　的Ｐｅａｋ　Ｉ和ＰｅａｋⅡ的Ｉｐ值相对标准偏差均为３．３　，传统收　集细胞质Ｐｅａｋ　Ｉ和ＰｅａｋⅡ的Ｉｐ值相对标准偏差分别为　２．０　和２．７７　，与传统细胞收集方法相比，原位收集细胞方　法的Ｉｐ值相对标准偏差值略高。但原位收集细胞法Ｐｅａｋ　Ｉ　和ＰｅａｋⅡ的Ｉｐ值相对标准偏差均小于５％。综上所述，原位　收集细胞法在细胞收集上优于传统收集细胞法。原位收集细　胞法能够简化繁琐的细胞收集步骤，缩短细胞收集时间，能　够减少操作过程对细胞活性的影响，降低实验过程中细胞样　品的损耗，有利于提高实验的灵敏度。　参考文献：　［１］Ｒｉｆａａｔ　Ｍ　Ａ．Ｌｏｗｅｒ　ｌｉｐ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｕｍｏｒ　ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ：ａ　ｓｉｎ—　ｇｌｅ　ａｕｔｈｏｒ’ｓ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｅｇｙｐｔ　Ｎａｔ　Ｃａｎｃ　Ｉｎｓｔ，２００６，ｌ８（４）：３２３—３３３　・９２・　黑龙江医药科学２０１４年２月第３７卷第１期　［２］Ｃｈｅｒｎｏｖ　Ｍ　Ｆ，Ｈａｙａｓｈｉ　Ｍ，Ｉｚａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｌｔｉｖｏｘｅｌ　ｐｒｏｔｏｎ　ＭＲＳ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ０ｎ　ｏｆ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｆｔｅｒ　ｇａｍｍａ　ｋｎｉｆｅ　ｒａｄｉｏｓｕｒｇｅｒｙ　ｆｏｒ　ｂｒａｉｎ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ［Ｊ］．　Ｂｒａｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｐａｔｈｏ１，２００６，２３（１）：１９－２７　［３］Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ　Ｖ。Ｍｉｓｈｒａ　ＡＫ，Ｄｗａｒａｋａｎａｔｈ　ＢＳ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｂｙ　２——ｄｅｏｘｙ－－Ｄ－－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｎ　ｈｕ－　ｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ，２００６，２（２）；５７—６４　［４］Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｉ　Ｇ，Ｂｅｒｎａｒｄｅｓｅｈｉ　Ｐ，Ｒｏｓｓｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．ｈｎａｔｉｎｉｂｍｅｓｙｌａｔｅ　ｉｎ－　ｄｕｃｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　１ｉｖｅｒ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｇａｓｔｒｏｉｎ—　ｔｅｓｔｉｎａｌ　ｓｔｒｏｍａ１　ｔｕｍｏｒ　ｆａｉｌｉｎｇ　ｉｎｔｒａ—ａｒｔｅｒｉａｌ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｒＪ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ，２００６，２（２）：６８－７１　［５］Ｗａｎｇ　ＬＹ．Ｔｕ　Ｚ．Ｌｕｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｂｙ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ［Ｊ１．ＣｏｎｆＰｒｏｃ　ＩＥＥＥ　Ｅｎｇ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｏｃｋ，　２００６，１：５８６８－５８７１　［６］Ｋａｔａｒｉａ　Ｔ，Ｒａｗａｔ　Ｓ，Ｓｉｎｈａ　Ｓ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　ｒａｄｉｏ—　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：ｏｕｒ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　ｉｎ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｓｓ　ｔｕｍｏｒ［Ｊ］．Ｃａｎ—　ｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ．２００６，２（４）：１６１－１６５　［７］Ｔｌｓｔｙ　Ｔ　Ｄ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　Ｌ　Ｍ．Ｔｕｍｏｒ　ｓｔｒｏｍａ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［－Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐａｔｈｏｌ，２００６，１：１１９—１５０　［８］Ｍａｒｔｈｙａ　Ａ，Ｐａｔｉｎｈａｒａｙｉｌ　Ｇ，Ｐｕｔｈｅｚｅｔｈ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉ—　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎｅ：ａ　ｃａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ａ　ｒａｒｅ　ｂｏｎｅ　ｔｕｍｏｒ［Ｊ］．Ｓｐｉｎｅ，２００７，７（６）：７１６—７１９　［９］徐翠林，蒋宁卫，包磊．雨花台区２００７年居民恶性肿瘤死因及疾　病负担及回顾性调查［Ｊ］．现代预防医学，２０１ｉ，３８（１８）：３７６１—　３７６３　［１０１宋卫亚，牟伟益，李涵，等．青岛市２０１０年恶性肿瘤住院情况及　年龄分布的调查口］．中国医院统计，２０１１，２；１８９—１９１　［１１］Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ａ，Ｓｔｅｉｎ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｏｓｓｉｆｙｉｎｇ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｍｏｒ　ｏｆ　ｉｎ－　ｆａｎｃｙ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｕｒｏｌ，２００７，３（３）：２５８—２６１　［１２］罗赛男，马爱霞．压缩新药研发成本的新动力［Ｊ１．上海医药，　２００７，（２）：６８－７０　［１３３武雪梅，栾积毅，李敬芬，等．酞菁包埋二茂铁聚合膜修饰电极对　抗坏血酸的电催化［Ｊ］．黑龙江医药科学，２００３，２６（４）：８－２５　（收稿日期：２０１３—１１—２８）　

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目，编号：Ｂ２０１００５；黑龙江省大学生创新训练计划项目，编号：２０１２ＸＪ０２９；黑龙江省　教育厅项目，编号：１２５１１５４２。　

作者简介：程冠华（１９９１～）男，黑龙江齐齐哈尔人，在读本科生。　通讯作者：武冬梅（１９６７￣）女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｕｄｍｅｉ６７＠１６３．ｃｏｒｎ。　

Ｓｔｕｄｙ　Ｏｆ　ｉｎ—ｓｉｔｕ　ｅｌ　ｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｏｆ　ＭＣＦ一７　ｅｅｌ　ｉ　ｓ　ＣＨＥＮＧ　Ｇｕａｎ—ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ—ｍｅｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｎｉａｎ—ｆｅ　ｇ，　Ｕ　Ｄａｎｇ—ｍｅｉ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ＂ｏｆ　Ｊｉａｍｕｓｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｍｕｓｉ　１５４００７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｉｇｎａｌ　ｏｆ　ＭＣＦ一７　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｉｎ—ｓｉｔｕ　ｅｌｅｃｔｒｏ—　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ　ｉｎ—ｓｉｔｕ　ｃｅｉｌｓ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃ—　ｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｙｃｌｉｃ　Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎ—ｓｉｔｕ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａ１　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｉｎ－－ｓｉｔｕ　ｃｏＵｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　Ｉｎ—ｓｉｔｕ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｒｔｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｃｅｉｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｉｎ－－ｓｉｔｕ　ｃｅｌｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｃｙｃｌｉｃ　Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ；ＭＣＦ一７