PCR引物设计原理 ppt课件
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PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
PCR技术介绍ppt课件
耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保护剂
精选PPT课件
4
02 基本实验步骤
实验参数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
熔解曲线 确认PCR反应的特异性。
精选PPT课件
11
Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
精选PPT课件
12
PCR
谢谢观看
Thanks
精选PPT课件
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
精选PPT课件
3
02 基本实验步骤
核酸模板 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
荧光探针法
精选PPT课件
9
Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
PCR教材教学课件
2000年
数字PCR技术诞生，提高了检测灵 敏度和特异性。
2010年至今
随着测序技术的发展，高通量测序 与PCR技术结合，推动了基因组学 和表观遗传学的研究。
PCR技术的未来发展方向
01
简化操作流程
通过改进试剂和仪器，降低PCR 技术的操作难度，提高实验效率
。
03
拓展应用领域
将PCR技术应用于临床诊断、生 物安全检测、环境监测等领域， 提高检测的广泛性和实用性。
仪器选择
选择性能稳定、高效的PCR仪器， 确保实验结果的可靠性和重复性。
样品处理
优化样品处理方法，减少样品纯化 时间，提高实验效率。
04
PCR实验结果分析
结果判断
阴性结果
阳性结果
如果PCR产物条带与阴性对照一致，说明未 检测到目标基因，可能为基因未表达或表 达量极低。
如果PCR产物条带与阳性对照一致，说明成 功扩增了目标基因，基因表达量较高。
。
05
PCR技术的发展与展望
PCR技术的发展历程
1983年
Kary Mullis在Cetus公司工作时，发 明了聚合酶链式反应（PCR）技术。
1985年
PCR技术获得美国专利，并获得诺贝 尔化学奖。
1989年
PCR技术被正式命名，并得到广泛应 用。
1993年
TaqMan荧光定量PCR技术问世，实 现了PCR的定量检测。
PCR的应用
基因克隆和基因组测序
用于获取目的基因或测定基因组序列。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA。
遗传疾病的诊断
检测基因突变或异常表达。
法医学鉴定
用于个体识别和亲子鉴定等。
02
数字PCR技术诞生，提高了检测灵 敏度和特异性。
2010年至今
随着测序技术的发展，高通量测序 与PCR技术结合，推动了基因组学 和表观遗传学的研究。
PCR技术的未来发展方向
01
简化操作流程
通过改进试剂和仪器，降低PCR 技术的操作难度，提高实验效率
。
03
拓展应用领域
将PCR技术应用于临床诊断、生 物安全检测、环境监测等领域， 提高检测的广泛性和实用性。
仪器选择
选择性能稳定、高效的PCR仪器， 确保实验结果的可靠性和重复性。
样品处理
优化样品处理方法，减少样品纯化 时间，提高实验效率。
04
PCR实验结果分析
结果判断
阴性结果
阳性结果
如果PCR产物条带与阴性对照一致，说明未 检测到目标基因，可能为基因未表达或表 达量极低。
如果PCR产物条带与阳性对照一致，说明成 功扩增了目标基因，基因表达量较高。
。
05
PCR技术的发展与展望
PCR技术的发展历程
1983年
Kary Mullis在Cetus公司工作时，发 明了聚合酶链式反应（PCR）技术。
1985年
PCR技术获得美国专利，并获得诺贝 尔化学奖。
1989年
PCR技术被正式命名，并得到广泛应 用。
1993年
TaqMan荧光定量PCR技术问世，实 现了PCR的定量检测。
PCR的应用
基因克隆和基因组测序
用于获取目的基因或测定基因组序列。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA。
遗传疾病的诊断
检测基因突变或异常表达。
法医学鉴定
用于个体识别和亲子鉴定等。
02
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
PCR技术原理与操作PPT
PCR步骤
PCR技术进行时的实验步骤及关键点。
1 准备反应体系
准确配制反应体系，对反应结果有决定性的 影响。
2 初始变性
94℃高温变性DNA，断与模板DNA结合，为复制DNA段提供模板。
中温度下，聚合酶按照引物模板，从5' 到 3' 延长新DNA链。
PCR反应体系与条件
PCR反应体系和条件对PCR反应质量的影响及优化方法。
反应体系
PCR反应液的主要成分是DNA模 板、引物、酶和缓冲剂等。
反应条件
包括温度、时间、酶的用量，不 同反应条件对反应结果有着明显 的影响。
优化方法
PCR后期的处理包括电泳分析、 测序等，也是PCR发现和应用的 重要方面。
PCR应用领域
PCR技术最新的应用案例及特点和优势。
1
鉴定GMO
利用PCR技术提供检测和确定转基因技术应用在食品中的程度和情况。
2
疫情监测
PCR技术在病原体检测、疫情监测等方面有广泛应用。
3
医学诊断
PCR技术已成为临床医学检测中最敏感的检测技术之一，成为诸多疾病的确诊手段。
PCR技术发展和创新
PCR技术的发展历程及当今应用的新技术和新方法。
蓝光PCR技术
利用DNA和RNA在紫外光和 蓝光照射下的发光原理进行 检测。
实时荧光定量PCR技术
将定量PCR与荧光检测技术 相结合，能够准确快速地检 测样本中的目标序列。
数字PCR技术
将PCR反应分隔为大量微小 空间进行，可有效减少标准 曲线算法的误差和PCR非特 异性增长的影响。
PCR技术的优缺点和局限性
无处不在
在病毒、遗传疾病的诊断和育种等领域都有广泛应用。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
《PCR检测技术》课件
02
pcr检测技术的基本原理
双链DNA的变性
加热至90-95摄氏度，双链DNA解旋为单 链。
高温下，氢键断裂，双螺旋打开。
维持在适宜的延伸温度，确保单链DNA 稳定。
引物与模板DNA的结合
设计特定序列的引物，与单链DNA模板 的互补序列结合。
引物在适宜的温度下与模板DNA结合， 形成起始复合物。
04
pcr检测技术的优缺点
pcr检测技术的优点
高灵敏度
PCR检测技术能够检测出极低浓
度的DNA或RNA，对于早期感染
或微量样本的检测非常有效。
01
特异性
02 通过设计特异的引物，PCR技术
可以特异性地扩增目标DNA或
RNA片段，避免非特异性扩增。
可定量性
通过荧光染料或探针标记，PCR
产物可以定量，适用于病毒载量
详细描述
通过检测肿瘤标志物或基因突变，PCR技术有助于肿瘤的早期发现和分类。同时，根据基因突变信息 ，可为肿瘤患者提供针对性的治疗方案，并监测治疗效果和预后。
法医鉴定与亲子鉴定
总结词
PCR技术为法医鉴定和亲子鉴定提供了可 靠的方法。
VS
详细描述
在法医鉴定中，PCR技术可用于个体识别 和身份确认，如DNA指纹分析。在亲子 鉴定中，通过检测遗传标记，可确定生物 学上的亲缘关系。
《pcr检测技术》ppt课件
CONTENTS
• pcr检测技术概述 • pcr检测技术的基本原理 • pcr检测技术的操作流程 • pcr检测技术的优缺点 • pcr检测技术的应用实例
01
pcr检测技术概述
pcr检测技术的定义
pcr检测技术
聚合酶链式反应技术，是 一种在体外快速扩增特定
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念