二仙汤疗效与细胞色素P450 1A2酶基因多态性关系的研究

・１２・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔ　ｉｏｎ　ｏｎ　ＴＣＭ　Ｊｕ１．２００８　Ｖｏ１．１５　Ｎｏ．７　二仙汤疗效与细胞色素Ｐ４５０　１Ａ２酶　基因多态性关系的研究　杨明，丁春燕，张娴，陈经宝，卢运田，唐波，朱首伦，曾星　（广州中医药大学第二附属医院，广东广州５１０１２０）　摘要：目的探讨二仙汤治疗男性更年期综合征临床疗效的个体差异与细胞色素Ｐ４５０　１Ａ２（ＣＹＰＩＡ２）酶基因单核　苷酸多态性的相关性。方法４８例肾阴阳两虚证男性更年期综合征患者使用二仙汤治疗３个月，采用伊斯坦布尔　Ｂｏｓｐｈｏｒｕｓ大学心理系症状量化评分法并参考（《中药新药临床研究指导原则》，对肾阴阳两虚证量化评分，用聚合酶　链反应（ＰＣＲ）扩增ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ基因，分析二仙汤的临床疗效与ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ酶基因单核苷酸多态性的关系。结果　治疗组与正常对照组之间基因型及等位基因分布无显著性差异，有效组３２例受试者中有１　６例的ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ基因　型为Ｇ／Ｇ（５６．２５％），无效组Ｉ６例受试者中有ＩＩ例的ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ基因型为Ｇ／Ａ（６８．７５％）。基因组间治疗前、治疗　后的症状、体征评分无明显差异；基因组间肾阴阳两虚证主证、次症评分也无明显差异。结论二仙汤治疗男性更　年期综合征个体含ＣＹＰ１Ａ２　Ｇ２９６４Ａ基因型为Ｇ／Ｇ有效率较高，个体含ＣＹＰ１Ａ２　Ｇ２９６４Ａ基因型为Ｇ／Ａ无效率较高。　关键词：二仙汤；男性更年期综合征：细胞色素Ｐ４５　０　１Ａ２　中图分类号：Ｒ２８５、６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５．５３０４（２００８）０７．００１２．０３　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＣＹＰ１Ａ２　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｅｒｘｉａｎ　Ｓｏｕｐ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ＹＡＮＧ　Ｍｉｎｇ，ＤＩＮＧ　Ｃｈｕｎ・Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｎ，ｅｔ　ａｌ　Ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＴＣＭ，　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０１２０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　１Ａ２　

（ｃＹＰ１￣）ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｅｒｘｉａｎ　ｓＨｏｐ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｖｏｒｔｙ—ｅｉｇｈｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｌｅ　ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　Ｙｉｎ　ａｎｄ　Ｙａｎｇ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ａ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｒｘｉａｎ　ＳＨＯｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｍｏｎｔｈｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｖｅｒｉｔｙ　ｏｆ　ｓｙｍｐｔｏｍｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　Ｅｒｘｉａｎ　ＳＨＯｐ　ｗｅｒｅ　ｑｕａｎｔｉｚａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍ＆ｈｏｄ　ｏｆＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｓｙｃｈｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｉｓｔａｎｂｕｌ　Ｂｏｓｐｈｏｒｕｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｕｉｄａｎｃｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｎ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕｇ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｃｈｉｎａ．Ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）ａｔ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　２９６４（Ｇ－ＡＪ　ｏｆ　ＣＹＰ１Ａ２　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰｅＲ）ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ａｎａｌｙｓｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｅｒｘｉａｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｎｄ　ＣＹＰＩＡ２　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｇｅｎｅｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｙｐｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　１６　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｍｏｎｇ　３２　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　Ｇ／Ｇ　（５６．２５０／０Ｊ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　１　１　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｍｏｎｇ　１６　ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　Ｇ／Ａ（６８．７５％）．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｅ－ｔｒｅａｔ　ａｎｄ　ｐｏｓｔ—ｔｒｅａｔ．　Ａｌｓｏｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓｈａｄｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｔｈｅ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆｍａｊｏｒｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｈｙｐｏｓｙｍｐｔｏｍｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　Ｇ／Ｇ　ｈａｖｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｗｈｉｌｅ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　Ｇ／Ａ　ｈａｖｅ　ｌｏｗｅｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｍｏｎｇ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ　ｇｅｎｅ　ｗｈｅｎ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｒｘｉａｎ　ｓｏｕｐ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｒｘｉａｎ　ｓｏｕｐ：ｍａｌｅ　ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＣＹＰＩＡ２　二仙汤是张伯讷教授２０世纪５０年代创建的治疗更年期综　合征的方剂，经过几十年的临床观察，已经成为治疗更年期综　合征的专方　。在临床上应用一组中药治疗同种症候相同的疾　病时，对一些患者有效，但对另一些患者效果较差或无效，这是　临床经常遇到的问题。为了进一步探讨这一问题，我们选用二　仙汤在治疗男性更年期综合征中出现的疗效差异，结合患者个　

基金项目：广东省中医药管理局课题（１　０６００８３）；广东省自然　科学基金（７００４８４０）　通讯作者：曾星，Ｔｅ１：０２０－８１　８８７２　３３－３０９０８，Ｅ－ｍａｉ　１：Ｘ－Ｚｅｎｇ￣　２１ｃｎ．ｃｏｍ　体差异与细胞色素Ｐ４５０　ＩＡ２（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　１Ａ２，ＣＹＰ１Ａ２）　酶基因单核苷酸多态性的相关性，初步探讨中药治疗中出现　的不同疗效个体对药物敏感性与药物代谢酶基因多态性的关　系。　１　临床研究　１．１病例选择　治疗组患者均来自本院男科门诊，共４８例肾阴阳两虚证　患者，年龄３５￣６１岁，平均５３岁；对照组来自本院自愿者，共　５５例，年龄３２￣４９岁，平均４１岁。　１、２入选标准　为了使患者症状诊断性筛查具有客观性，采用伊斯坦布尔　

维普资讯 http://www.cqvip.com ２００８年７月第１５卷第７期　中国中医药信息杂志　・１３・　Ｂｏｓｐｈｏｒｕｓ大学心理系将症状量化的方法，对男性更年期综合　征症状评分，体能症状＋血管舒缩症状≥５分、精神心理症状　＞／４分、性功能症状＞／８分者可诊断为男性更年期综合征　。　男性更年期综合征肾阴阳两虚证中医诊断：根据《中药新　药临床研究指导原则》，参考“肾阳虚证及。肾阴虚证的临床研　究指导原则”　明确中医诊断。主证：腰膝酸痛，畏寒肢冷，性　欲减退，舌质淡黯，苔白干，脉沉细无力。次证：精神不振，头目　眩晕，耳鸣，梦多易醒，脱发，夜尿频多，大便时秘时泄。按症状　轻重分级，分为４级。　１．３排除标准　①有急、慢性肝肾功能损害者和心功能损害者；②有睡眠　呼吸暂停综合征者；③有红细胞增多症者：④前列腺癌、良性前　列腺增生伴排尿障碍者；⑤有严重心血管疾病及脑卒中病史者。　１．４治疗方法　使用二仙汤治疗：仙茅１５　ｇ，淫羊藿１５　ｇ，巴戟天１０　ｇ，　当归１０　ｇ，知母１０　ｇ，黄柏１０　ｇ。每日１剂，水煎至１５０￣２００　ｍＬ，　分２次服，１２周为１个疗程。　１．５疗效观测　总分值＝中医肾阴阳两虚证相关症状及体征分值＋男性　更年期综合征相关症状及体征分值。疗效指数＝（治疗前症状　评分总分值一治疗后症状评分总分值）／治疗前症状评分总分　值。　１．６疗效判定标准　有效：男性更年期综合征症状、体征好转：疗效指数＞／３０％。　无效：男性更年期综合征症状、体征无改善；疗效指数＜３Ｏ％。　２实验研究　２．１试剂　ＯＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ，Ｓｕｐｅｒｂｌｉｘ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，　英韦创津生物有限公司。内切酶Ｂｓｐｌ２０Ｉ，内切酶Ｄｄｅｌ，内切酶　Ｒｓａｌ，英韦创津生物有限公司。Ｔｒｉｓ／Ａｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄ／ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ　５０×１Ｌ　Ｂｉｏ—Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒｓ（５０　ｂｐ），晶美生　物工程有限公司。　２．２方法　２．２．１　ＤＮＡ提取取静脉血２　ｍＬ，经溶膜液／蛋白酶Ｋ消化，　常规提取基因组ＤＮＡ。　２．２．２　ＰＣＲ扩增①在各个反应管中分别加入ＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　４５　，ＩＦ、１Ｒ（ＩＯ　ｐ．ｍｏｌ／　）各１　，ＤＮＡ模板　各２　。②１　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心１　ｍｉｎ，混匀。③放到ＰＣＲ仪上　进行ＰＣＲ反应。④将ｌＦ、ｌＲ为引物扩增的ＰＣＲ产物酶切。⑤　ＤｄｅＩ酶切片段电泳，判断基因型。一次性凝胶系统下拍照，根　据条带判断其基因型：若出现了４６４　ｂｐ、１３２　ｂｐ两个条带，　则其为突变基因型Ａ／Ａ：若出现了５９６　ｂｐ、４６４　ｂｐ、１３２　ｂｐ　三个条带，则其为杂合基因型Ｇ／Ａ；若仅出现了５９６　ｂｐ一个条　带，则为野生基因型Ｇ／Ｇ（见图１）。　２．３统计学方法　采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件包建立数据库，基因分值组间比　较采用方差分析，方差不齐者采用秩和检验（Ｗｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌ１ｉｓ　Ｈ），　计数资料组间构成比比较采用　检验，检验水平ｏ＝０．０５。　

１８　１７　１６　１５　１４　１３　１２　１１　１０　９　８’７　６　５　４　３　２　１　注：１：Ｍａｒｋｅｒ，４、５、７、９、１０、１２、１５、１６、１７、１８：Ｇ／Ｇ基因型；　２、３、６、８、１１、１４：Ｇ／Ａ基因型；１３：Ａ／Ａ基因型　圈１　ＧＹＰ１Ａ２　Ｇ２９６４Ａ基因扩增后ＤｄｅＩ酶切电泳图　３结果　所提取的ＤＮＡ经过Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ　４０００　ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏ—　ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ测定，其纯度均在１．７～１．９之间，可用于ＰＣＲ扩增　反应。　３．１　ＣＹＰＩＡ２　Ｇ２９６４Ａ基因型及等位基因分布　治疗组与对照组的基因型及等位基因分布差异无显著性　意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。２组间的人口学分布特征无差异（见表１）。　表１　ＣＹＰ１Ａ２　Ｇ２９６４Ａ基因型及等位基因分布［例（％）］