荧光原位杂交
荧光原位杂交 操作
荧光原位杂交操作荧光原位杂交（FISH）是一种基因组学的技术，它使用荧光探针将特定的DNA序列定位在染色体上。
这种技术被广泛用于分析染色体的结构和功能，以及人类基因组变异和疾病的研究。
本文将介绍荧光原位杂交操作的步骤。
步骤1：样品制备FISH技术可以应用于不同种类的样本，如人类细胞、动植物组织等。
对于人类细胞的样本，常用的方法是将细胞分离，制作成染色体悬液。
首先要通过荧光染色法把两种不同的染色体和特定的基因序列染成不同的颜色。
这需要用到已知基因序列的探针，可以从已有的文献中获取。
如果没有，可以通过设计和合成新的探针。
步骤2：制作探针FISH探针是由一段DNA片段制成的。
这个片段可用PCR方法从DNA中扩增出来，或者可以通过化学合成的方法制造。
制造探针时需要注意，探针的长度和序列应该与目标序列相匹配，可以通过BLAST或其他基因数据库检索确认。
通常使用荧光染料标记探针，以便在镜头下观察到探针的定位。
常用的标记分子有荧光素（FITC），荧光素同路胺（rhodamine）和锔（Cy3和Cy5）。
这些分子的选择取决于探针和荧光显微镜系统的兼容性。
在制作FISH探针时，需要注意探针的特异性和灵敏度。
为了达到这一目的，需要经过一系列的标记、纯化和探针肢解操作。
探针一般都是双链DNA，通过加入单链转化酶（S1）或DNA酶I，使双链DNA变成单链DNA，并标记在其5'-末端上。
标记完成后，进行染色体裂解、脱氧核糖核苷酸（dNTP）和DNA聚合酶的反应来进行回收和标记探针，以免对染色体质量产生影响。
对于高复杂度的基因组，可以使用克隆探针阵列，在单个染色体上定位多个序列。
步骤4：染色体固定和前处理将样本固定在载玻片上，这可以是用乙醛和甲醛等固定剂进行固定。
将载玻片上的样本通过逐步浸入水，逐步替换固定样本中的有机溶剂来除去样本中的RNA，然后用类碱/类酸（如乙酸/氯化锂，0.1M Na丙二酸缓冲pH 9.0）进行前处理，以增加荧光探针的穿透率，使其更好地结合DNA的目标序列。
荧光原位杂交的原理及在产前诊断中的应用
荧光原位杂交的原理及在产前诊断中的应用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种基于核酸互补配对原理的分子生物学技术，通过标记的探针与待测样品中的特定序列发生互补配对，从而实现对特定基因或染色体的定位和检测。
这项技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的特点，因此在产前诊断中得到了广泛的应用。
荧光原位杂交的原理是利用互补配对原则，即DNA的碱基对A与T之间形成两个氢键，而G与C之间形成三个氢键。
荧光原位杂交实验中，首先需要制备特异性的探针。
探针一般是由DNA片段或人工合成的寡核苷酸链构成，其中的核酸序列与待测样品中的目标序列互补配对。
探针的核酸链上标记有荧光染料，通过荧光信号可以检测到探针的靶向结合。
在荧光原位杂交实验中，首先需要对待测样品进行固定处理，使DNA在细胞或组织中得以保持原有的空间结构。
然后，将标记有荧光染料的探针与待测样品进行孵育，在适当的温度下让它们发生互补配对反应。
随后，利用荧光显微镜观察标记的探针是否与待测样品中的目标序列结合，并通过图像分析系统对荧光信号进行定量和定位分析。
荧光原位杂交技术在产前诊断中发挥了重要的作用。
产前诊断是指在胚胎发育早期对胚胎进行检测，以确定胚胎是否存在异常基因或染色体异常。
常见的产前诊断方法包括羊水穿刺、脐带血采样等，但这些方法对胚胎有一定的损伤风险。
相比之下，荧光原位杂交技术具有无创伤、准确、快速等优势。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术主要应用于染色体异常的检测。
例如，唐氏综合征是由于染色体21上三个同源染色体的非整倍体所导致的一种遗传病。
通过使用标记有荧光染料的探针与染色体21上的特定序列发生互补配对，可以在荧光显微镜下观察到染色体21的异常数量和结构，从而诊断是否存在唐氏综合征。
荧光原位杂交技术还可用于检测其他染色体异常，如父源性染色体易位、染色体缺失或重复等。
通过选择特定的探针，可以针对不同的染色体异常进行检测和分析。
荧光原位杂交探针设计
荧光原位杂交探针设计荧光原位杂交探针（Fluorescence in situ hybridization probes）是一种用于检测和定位细胞或组织中特定DNA或RNA序列的方法。
它是一种高度敏感且特异的技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
本文将介绍荧光原位杂交探针的设计原理和方法，并探讨其在科学研究和医学诊断中的应用。
1. 荧光原位杂交探针的原理荧光原位杂交探针的设计基于亲和性配对原理。
DNA或RNA的序列与其互补的探针序列发生特异性结合，形成稳定的双链结构。
探针序列的标记物（通常是荧光染料）可以通过显微镜观察到，从而确定目标序列的存在和位置。
2. 荧光原位杂交探针的设计方法荧光原位杂交探针的设计通常包括以下步骤：（1）目标序列选择：根据研究目的选择需要检测的DNA或RNA序列。
（2）探针序列设计：根据目标序列设计互补的探针序列，通常长度在20-50个碱基对之间。
（3）标记物选择：选择合适的荧光染料或其他标记物，以便在显微镜下观察到探针序列的信号。
（4）探针合成：利用化学方法合成标记物修饰的探针序列。
（5）杂交反应：将探针与待检测的样品（细胞或组织）进行杂交反应，使探针与目标序列结合。
（6）信号检测：利用荧光显微镜或其他适当的检测方法观察和记录探针信号。
3. 荧光原位杂交探针的应用荧光原位杂交探针在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用，包括：（1）基因定位：可以确定染色体上特定基因的位置和数量，研究基因组结构和功能。
（2）肿瘤诊断：可以检测肿瘤细胞中的染色体异常和基因突变，提供肿瘤分类和预后评估的依据。
（3）细胞遗传学研究：可以观察到细胞中染色体的数目和结构变化，研究细胞遗传学过程。
（4）病原体检测：可以检测病原体的存在和数量，用于感染性疾病的诊断和监测。
荧光原位杂交探针是一种强大的工具，可以帮助科学家和医生了解细胞和基因组的结构与功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
随着技术的不断发展和创新，相信荧光原位杂交探针将在更多领域展现其巨大潜力，并为人类健康做出更大的贡献。
荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交（FISH ）实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH ）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb ，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物素标记DNA 探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
实验用具及材料 相关溶液的配制1）20×SSC ：175.3g NaCl ，88.2g 柠檬酸钠，加水至1000mL （用10mol/L NaOH 调pH 至7.0）。
tsa荧光原位杂交法
tsa荧光原位杂交法
TSA荧光原位杂交法（Tyramide Signal Amplification Fluorescence In Situ Hybridization）是一种用于检测蛋白质或
核酸表达的方法。
该方法是在常规原位杂交的基础上引入了TSA荧光信号放大
技术。
在该方法中，首先将标记有特定荧光物质的探针与待测样品中的目标分子结合，形成杂交复合物。
然后使用辣根过氧化物酶结合物（HRP）标记的亲和试剂结合到杂交复合物上，再加入过氧化物酶底物和有机过氧化物，促使荧光信号的产生。
由于有机过氧化物的作用，信号放大，使得目标分子的表达区域更加明显，并且可以在荧光显微镜下观察和定量化。
TSA荧光原位杂交法具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的
优点，并且可以应用于细胞、组织和固定的病理学切片等多种样品类型。
它在生物医学研究、基因组学和分子诊断等领域发挥着重要作用，有助于了解基因表达和蛋白质定位等关键信息。
端粒绝对长度荧光原位杂交
端粒绝对长度荧光原位杂交
端粒绝对长度荧光原位杂交（Absolute Telomere Length Fluorescence In Situ Hybridization，aTL-FISH）是一种用于测量染色体端粒长度的分子生物学技术。
端粒是染色体末端的保护结构，起到保持染色体稳定性和避免损伤的作用。
而端粒长度与细胞衰老和疾病发展密切相关，因此测量端粒长度对于研究细胞老化、癌症和其他相关疾病具有重要意义。
在aTL-FISH技术中，使用一种特殊的DNA探针，该探针与端粒DNA序列互补。
这种探针标记有荧光染料，能够与端粒DNA结合。
实验过程中，首先将细胞样本固定在载玻片上，然后通过处理，使细胞内的染色体处于解旋并暴露出端粒区域。
接着，将标记有荧光的端粒DNA探针与细胞样本一起孵育。
荧光探针会与端粒DNA序列结合形成特定的信号。
最后，使用显微镜观察荧光信号，通过图像分析软件定量测量细胞中的端粒长度。
这样就可以获得每个细胞的端粒长度数据，进而对整个细胞群体的端粒长度进行分析和比较。
aTL-FISH技术能够提供端粒长度的定量信息，帮助研究人员了解染色体的稳定性、细胞衰老和疾病的发展过程。
它被广泛应用于生物医学研究中，特别是与细胞老化、癌症和疾病相关的研究领域。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
端粒绝对长度荧光原位杂交
端粒绝对长度荧光原位杂交端粒绝对长度荧光原位杂交是一种用于测量染色体末端端粒的方法。
端粒是染色体末端的重要结构，它们在维持染色体的稳定性和功能方面起着关键作用。
端粒绝对长度的测量可以提供有关细胞老化、癌症发展和干细胞功能的重要信息。
在这篇文章中，我们将探讨端粒绝对长度荧光原位杂交的原理、技术和在科学研究中的应用。
端粒绝对长度荧光原位杂交的原理是基于原位杂交的技术。
它使用与端粒DNA互补的荧光标记的探针与细胞中的端粒DNA结合，通过荧光显微镜观察和测量。
这种方法可以提供与其他已有方法不同的优势，例如，它对单个细胞进行测量，可以提供更准确和细致的端粒测量结果。
在进行端粒绝对长度荧光原位杂交前，首先需要制备与端粒DNA互补的荧光标记的探针。
这些探针可以通过合成DNA序列和荧光染料标记的方法制备而成。
然后，将这些探针与细胞进行杂交反应，在适当的条件下，使探针与端粒DNA结合。
之后，使用荧光显微镜对样本进行观察，并使用相应的图像分析软件进行端粒的测量和分析。
端粒绝对长度荧光原位杂交不仅可以提供端粒绝对长度的测量，还可以用于观察端粒的结构和形态变化。
通过在不同细胞类型、组织类型以及不同生理条件下进行端粒绝对长度的测量，可以比较不同样本之间的端粒长度差异，进而研究细胞老化、发育过程以及癌症发展等相关问题。
在科学研究中，端粒绝对长度荧光原位杂交有着广泛的应用。
例如，在细胞老化研究中，测量细胞端粒绝对长度的变化可以提供有关细胞老化过程的重要信息。
此外，它还被用于研究不同癌症类型的细胞端粒长度以及其与癌症进展的关系。
此外，由于干细胞具有较长的端粒，端粒绝对长度荧光原位杂交也被用于研究干细胞的功能和特性。
总之，端粒绝对长度荧光原位杂交是一种重要的技术，用于测量染色体末端的端粒。
它可以提供有关细胞老化、癌症发展和干细胞功能的重要信息。
在科学研究中，它已被广泛应用于各个领域，并取得了重要的研究进展。
随着技术的进一步发展，端粒绝对长度荧光原位杂交将继续在生命科学领域中发挥重要作用，并为我们深入了解染色体的端粒结构和功能提供更多的机会。
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探针的非放射性标记
第四军医大学
间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交 后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可 将检测信号放大，监测到小至５00 bｐ的靶序 列）
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记 探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。（检 测步骤简单，但不能将信号放大，不如间接标 记的探针灵敏）
种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可
以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
Applications of FISH
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➢ 基因组结构研究； ➢ 染色体精细结构变异分析； ➢ 病毒感染分析； ➢ 人类产前诊断； ➢ 肿瘤遗传学；
基因组结构研究
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探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的与 目的基因互补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来源可分为“cDNA探针、基因组探 针、寡核苷酸探针与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链 （cDNA）——用碱除去mRNA
荧光原位杂交（FISH）
Fluorescence in situ hybridization
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FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA 变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下 退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光 显微镜观察杂交信号。
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FISH技术的优点
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：
1、荧光试剂和探针经济、安全； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探
针相当； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多
探针类型
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1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵 母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的 易位、缺失和扩增。
2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的 全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检 测染色体数目或结构异常。
3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异 常。
非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连 接到 dUTP 等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过 酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作 用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素 （FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、 吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等
2.“基因组探针”是把染色体DNA通过超声击断或以限制性内切酶不完全水解——获得许 多染色体DNA随机片段——择长度约15-20kb（千对碱基）的DNA片段重组到λ噬菌体中— —经体外包装转染大肠杆菌——筛选出含目的基因的大肠杆菌——扩增后提取质粒—— 酶切分离目的基因。
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染色体精细结构变异分析
Viral Infections
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Prenatal Diagnosis
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以21号染色体的相应片段序列 作探针，与外周血中的淋巴细 胞或羊水细胞进行原位杂交， 可快速、准确进行诊断。
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切口平移法：
切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口， 大肠杆菌 DNA聚合酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为 模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷 酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均 一标记DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互 补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始 合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互 补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。
FISH发展
➢ 1969年，同位素标记的DNA探针； ➢ 1974年，染色体显带技术与原位杂交结合； ➢ 1981年，荧光素标记的cDNA探针； ➢ 90年代后，多色探针出现。
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探针的发展
放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的 条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（P32），档标 记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用 低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于 灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致北京过高而难以分辨 出真正信号。
3.“寡核苷酸探针”为人工合成的DNA片段，一般长约20-50个bp（碱基）。可根据 已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的 氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。由于DNA自动合成仪的出现使探针的合成 十分方便。
4.“RNA探针”制备的技术路线为：将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质 粒的多克隆位点——以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一 部位消化重组质粒——使之成为线性DNA——在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下， 以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第 二条链的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的
染色体涂染探针：判断易位染色体
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8号染色体探针
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α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着 丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位 组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝 粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针 的来源。