微生物荧光原位杂交实验技术
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）
是一种用于检测和定位靶标DNA序列的方法。
其原理是利用
荧光标记的DNA探针与靶标DNA特异性结合，通过荧光显
微镜观察细胞核内荧光信号的强度和位置，从而确定目标
DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术的步骤包括标记DNA探针、固定细胞样品、使细胞核开放透明化、探针与目标DNA杂交、洗涤去掉无特
异连接的探针、显微镜观察和分析。
在标记DNA探针的过程中，将目标DNA序列特异性引物和
荧光标记的核苷酸引物结合，通过聚合酶链反应使DNA探针
荧光标记。
标记DNA探针可以选择性地与目标DNA序列进
行互补结合。
固定细胞样品后，可以通过化学方法将细胞膜破裂并使细胞核透明化，使DNA探针能够更好地进入细胞核。
随后将标记好
的DNA探针加入样品中，在适当的温度下进行DNA杂交反应。
如果目标DNA序列在细胞核中存在，则DNA探针与目
标DNA序列结合，形成探针-目标DNA复合物。
在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除无特异连接的DNA
探针。
这样可以提高荧光信号的特异性和强度。
最后，利用荧光显微镜观察样品中的荧光信号。
荧光探针与目标DNA序列结合后会发出特定颜色的荧光信号，可以通过观
察荧光信号的位置和强度来确定目标DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术可以应用于医学诊断、基因定位等领域，成为研究细胞遗传学和基因组学的重要工具。
荧光原位杂交
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。
下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。
非生物学专业的同学请不要往下看了。
1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。
3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法
FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。
-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。
3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。
-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。
（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交操作技术(川农小麦所)
荧光原位杂交操作技术（四川农业大学小麦研究所）1．制片：取固定1-7天的根尖，醋酸洋红制片，液氮揭片，-20度低温冰箱中贮存备用（在载玻片上用刀刻出染色体位置）；用前以95%和100%酒精脱水，各5分钟。
2．探针制备：用Roche公司的Dig-Nick Translation Mix试剂盒按照说明书所述程序制备，置于-20度备用。
3．DNA变性：每张载玻片上加100微升70%甲酰胺(formamide)2 X SSC贮存液，盖上24X24 盖玻片，直接放在80度变性2分钟(可在PCR仪中变性)；取出玻片，轻轻甩掉盖玻片，此步骤动作必须快。
（若发现染色体较粗壮的话，可适当缩短变性时间）70%甲酰胺2XSSC贮存液：1000ul体系：甲酰胺700ul2 X SSC 300ul4．迅速将变性好的载玻片放在预冷（-20度）的70%，95%，100%乙醇中各处理5分钟。
其间用镊子不停晃动载玻片，完后将片子夹出，用纸抹去背面多余的乙醇。
气干。
5．配杂交液：取下列药品放入1.5ml EP管中：去离子甲酰胺（formamide）7.5ul20 X SSC 1.5ulSSDNA（鲑精DNA） 1.5ul50% DS（硫酸葡聚糖）3ulBlocking DNA(封阻) 0.5ulProbe DNA(探针，最后加) 1ul共为15微升体系，加探针后需瞬时离心以混匀。
Note: 探针DNA与封阻DNA浓度比大致控制在40-160（根据基因组间亲缘关系调整此比例）将混合的杂交液在80度条件下变性10分钟(可在PCR仪中变性)，完后迅速取出放在冰水盒中，让冰完全覆盖至少5分钟。
6．确认载玻片已完全变干，将杂交液（15ul）用移液枪加在染色体位置处（已做标记），迅速盖上18X18载玻片，用Rubber Cement将盖玻片周围密封，放在湿润不透光的盒子中37度处理过夜。
注意：此步骤应在避光条件下操作；加杂交液时，须保证无气泡产生；涂Rubber Cement的目的是防止杂交液在37度条件下变干。
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。
1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。
20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
实验流程FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。
特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。
采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。
FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。
六大优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
荧光原位杂交操作步骤
荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。
一、样本准备。
要做这个实验，先得把样本处理好。
如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。
这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。
要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。
然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。
二、探针准备。
接下来就是探针啦。
探针就像是专门去找目标的小侦探。
得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。
把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。
三、杂交反应。
然后就到了杂交这一步啦。
把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。
这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。
然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。
在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。
四、洗涤。
杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。
这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。
用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。
五、检测。
最后就是检测啦。
这时候要用专门的荧光显微镜去看。
打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。
如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。
那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。
荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
微生物荧光原位杂交实验技术
背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展
而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探
针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并
保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处
理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
中国明对虾和栉孔扇贝是我国重要的海洋生物资源，具有很高的经济价值和生态意义。
随着分子生物学和基因组学的发展，对这些海洋生
物的基因进行研究变得越来越重要。
本研究旨在利用荧光原位杂交技术对中国明对虾和栉孔扇贝的若干重要基因进行定位，为深入了解它们的基因组提供基础数据，也为保护和利用这些海洋生物资源提供理论支持。
荧光原位杂交技术是一种先进的分子生物学技术，可以用于定位特定DNA序列在染色体上的位置。
本研究采用该技术，首先选取了若干重要基因的特异性探针，包括免疫相关基因、代谢相关基因和生长相关基因等。
然后，将这些探针与对虾和扇贝的染色体进行杂交，再用荧光染料标记，最后通过荧光显微镜观察并记录杂交信号的位置。
实验结果表明，所有选取的探针都成功地与中国明对虾和栉孔扇贝的相应基因进行了杂交，并产生了明显的荧光信号。
通过分析这些信号的位置，我们发现这些重要基因在两个物种的染色体上呈现出不同的分布和拷贝数。
我们还发现了一些与性别决定和染色体数目相关的基因位点，为进一步研究提供了有价值的信息。
本研究利用荧光原位杂交技术成功地对中国明对虾和栉孔扇贝的若干重要基因进行了定位，揭示了这些基因在两个物种的染色体上的分布和拷贝数差异。
这些结果不仅丰富了我们对这两种海洋生物基因组的认识，也为保护和利用这些资源提供了有益的信息。
未来，我们可
以进一步研究这些基因的表达和功能，以期为海洋生物资源的保护和利用提供更多理论支持和技术手段。
酵母单杂交筛选实验是生物学研究中常用的一种技术，它能够帮助研究者们在复杂基因组中快速有效地寻找与特定蛋白质相互作用的蛋
白质因子。
本文将探讨酵母单杂交筛选实验中的几个关键问题。
实验流程中的每一个步骤都至关重要。
在组织切片过程中，需要保证样本的新鲜度和完整性。
免疫荧光染色则是对蛋白质进行标记的过程，此步骤需注意抗体的选择以及荧光染料对细胞的毒性。
实验完成后，结果通常以阳性克隆和阴性克隆的生长曲线图以及免疫荧光染色的图片形式呈现。
这些结果反映了酵母单杂交筛选实验的效果如何。
对于实验结果，我们需要进行分析。
在生长曲线图中，我们可以观察阳性克隆和阴性克隆的生长速度以及菌落的形态特征。
免疫荧光染色的图片则可以展示蛋白质在细胞内的分布情况。
这些指标均能直观地反映出酵母单杂交筛选实验的效果。
在分析实验结果的我们也需对实验过程中出现的问题进行总结。
比如，某些步骤的实验条件可能需要进一步优化，以便提高阳性克隆的筛选
效率。
另外，抗体的选择、荧光染料的用量以及细胞培养条件等也需注意。
酵母单杂交筛选实验在生物医学领域具有广泛的应用价值。
然而，要获得更为准确可靠的实验结果，我们必须实验过程中的每一个细节，不断优化实验条件，提高实验的可重复性和可扩展性。
只有这样，我们才能更好地利用酵母单杂交筛选实验为生命科学研究服务。