荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
组织细胞荧光原位杂交检查
组织细胞荧光原位杂交检查组织细胞荧光原位杂交检查：新时代肿瘤诊疗的重要手段组织细胞荧光原位杂交检查（FISH）是一种现代肿瘤检测手段，已被广泛应用于癌症诊断、预后评估和治疗选择等方面。
本文将从技术原理、临床应用和未来发展三个方面进行介绍。
技术原理FISH技术首先需要获得肿瘤组织标本，并进行脱水、固定和切片等预处理。
随后，通过特定的探针标记DNA部位，FISH技术可以准确地检测染色体异常、基因拷贝数变异和染色体重排等基因结构异常。
同时，FISH技术能够利用荧光标记的探针直接定位到细胞核内某个部位，提高了细胞水平的检测精度。
临床应用FISH技术在临床上主要用于癌症检测和治疗决策。
例如，FISH技术可以检测HER2基因的扩增情况，预测HER2阳性乳腺癌患者对赫赛汀治疗的敏感性和疗效。
此外，FISH技术还可以检测多种癌症患者的病理类型、亚型和分级等信息，有助于个体化治疗的制定和预后评估的精准性提高。
FISH技术还可以应用于遗传学疾病的诊断和预测等方面。
未来发展随着生物技术的迅猛发展，FISH技术的应用范围将更加广泛。
例如，利用荧光标记的超高分辨率探针，可以实现单基因级别的检测。
此外，结合缺损补偿系统、多肽分子探针等新技术，FISH技术将更加高效、快速、精确地检测细胞内的基因变化和功能异常。
同时，在分子分型、免疫分析、仿生工程等多领域的应用下，FISH技术的潜力已经远远超出了当前的肿瘤诊疗范畴。
总之，FISH技术作为一种现代肿瘤检测手段，具有高度的准确性、灵敏度和特异性，为癌症诊断和治疗决策提供了重要依据。
随着技术的不断创新和应用范围的扩展，FISH技术的发展将为肿瘤诊疗带来新的突破和希望。
（注：本文700字）。
什么是荧光原位杂交（FISH）？
什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。
”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。
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01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。
在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。
FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。
这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。
02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。
懂了原理，才能以不变应万变。
因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。
刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。
（2）蛋白酶K的作用浓度。
浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
荧光素原位杂交
荧光素原位杂交
荧光素原位杂交（FISH）是一种高灵敏度，高特异性的分子解剖技术，它可以在细胞和分子水平上检测某一特定基因的存在和位置。
荧光素原位杂交是一种可以识别特定基因（目标基因）在特定基因组内位置，确定目标基因的复制数等的分子生物学技术。
该技术和其它一些分子生物技术一起，使我们能够理解基因的调控、功能和遗传性的机制。
荧光素原位杂交是由弗朗斯·勒罗（Franz Lerner）和Ralph Rapley于1989年独立发明的，它使用荧光素作为探针，由一种荧光素探针与另一种荧光素探针结合制作而成，可以检测
目标基因在{指定的DNA片段上的位置。
荧光素原位杂交技术由原位杂交（IF）和荧光原位杂交（FISH）组成，FISH的过程包括荧光素标记、原位杂交、固定、染色和荧光素检测五个步骤。
第一步是将探针结合荧光素标记，第二步是将标记的探针与样品中的DNA片段结合，以形成杂交物，第三步是将杂交
物固定在载体上，第四步是进行染色，第五步是鉴别杂交区域并直接检测荧光素。
在生物医学研究领域，FISH已经广泛应用于多种疾病的诊断。
它可以检测遗传和病理性
疾病，如亚型特异型慢性粒细胞白血病、慢性克隆细胞白血病和体核异常的诊断等，这些
疾病常常受到其他分子检测技术的限制。
此外，FISH还可以用于检测肿瘤克隆，可以检
测在肿瘤恶化和转移过程中的基因调控，为癌症早期诊断和治疗提供了可靠可靠的依据。
荧光素原位杂交这种既高灵敏又高特异的分子生物学技术，不仅可以为疾病诊断提供非常便捷和精准的方法，而且还可以帮助人们了解疾病发病机理，为疾病治疗和预防提供重要
的研究基础。
浅谈荧光原位杂交技术(fish)在诊断精子多倍体中的应用研究进展
浅谈荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展浅谈荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展摘要：近年来，由于FISH 技术具有安全、快速及灵敏度高的特点，在诊断精子多倍体中得到了广泛应用，本文主要对荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展进行综述。
关键词：FISH技术精子多倍体1、荧光原位杂交（FISH）技术的概念及原理荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，FISH的基本原理是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。
2、异种体外受精技术的限制精子染色体检测方法主要有异种体外受精技术（人精子?仓鼠卵融合技术）制备人精子染色体和精子FISH分析[1，2]。
1978年Rudak[3]等采用异种体外授精技术首次制备出人精子染色体标本，此方法可以直接观察到精子全部染色体组成，精确分析染色体结构、数目。
但是由于这一技术需要模拟体内精卵结合，以及需要保证体外精子获能的条件和仓鼠的超排卵数等，技术难度大、实验条件要求高，制片成功率低，因此限制了此技术的广泛应用。
3、 FISH技术检测非整倍体的优点非整倍体是导致人类胚胎丢失和染色体疾病的主要原因之一，而非整倍体的产生是由于生殖细胞减数分裂过程中的染色体不分离造成的，因此，阐明非整倍体产生的机制具有重要的意义。
目前，国内外大部分的研究者都通过收集一定数量质量异常与正常的精液标本，通过应用XY性染色体重复序列探针，对处理后的精子细胞进行荧光原位杂交分析，探讨FISH技术在诊断精子多倍体中的应用，从而建立各自实验室精子FISH分析的技术平台，这种方法有助于患者的遗传咨询、PGD异常胚胎的风险预测及携带者有无PGD必要性的评估。
DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述
DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述DNA荧光原位杂交（FISH）技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术，它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。
利用FISH进行DNA序列的定位具有实验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点。
总的说来，FISH技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH新技术，如Muticolor-FISH、CGH、GISH、CISS、BAC-FISH、Chromosome Painting、Rreverse Chromosome Painting等等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，使其分辨率由1Mb 发展到1kb,这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。
A．不同探针的应用：1．以基因组为探针的GISH技术可以定位外源DNA片段在染色体上的位置、大小、插入点等。
Durnam（1985）首先将GISH应用于体细胞杂种的异源染色体检测。
本实验室采用GISH方法在小麦中成功定位了许多外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异。
2．以不同的荧光素标记探针的Muticolor-FISH，可以同时定位不同探针序列的分布。
1990年Nederlof等创建了多色荧光原位杂交技术。
他们用生物素、AAF（氨基乙酰荧光素）和CP三种半抗原对不同探针作单、双、三标记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）、氨甲香豆素乙酸（AMCA，蓝色）和碱性蕊香红（TRITC，红色）的抗体来检测荧光，该技术最多可同时观察7个靶染色体。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交技术(FISH)常见问答
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答1.对于FISH操作来说，那些因素比较重要?在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
2.在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果?发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。
在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。
此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。
因此保证FISH操作中的温度非常重要。
3.该如何保证FISH 操作中的温度?最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内)。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多(10ul)，因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
4.使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。
但随后信号急剧衰减。
几分钟后信号就消失了。
这是探针本身的质量问题吗?在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。
出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。
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荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名
fish
外文名
fluorescent in situ hybridization
建立时间
1986年
发展历程
1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时
原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤
编辑播报
（1）样品的固定；
（2）样品的制备和预处理；
（3）预杂交；
（4）探针和样品变性；
（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；
（6）漂洗去除未结合的探针；
（7）检测杂交信号，进行结果分析
·荧光信号观察：
将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
种属鉴定
·FISH最常使用的靶序列是16S rRNA，根据rRNA目标区域可设计寡核苷酸探针，进行种属特异性鉴定；
（1）寡核苷酸探针FISH技术
·最常用的寡核苷酸探针一般是15-30 bp，短的探针易于结合
到靶序列，但一般很难被标记；·探针的标记有直接标记和间接标记两种；
（2）核酸肽探针FISH技术
·核酸肽（Peptide Nucleic Acid，PNA）：一种不带电荷的DNA 类似物，其主链骨架是由重复的N-（2-氨基乙基）甘氨酸以酰胺键聚合而成，碱基通过亚甲基连接到PNA分子的主链上。
·PNA/DNA分子杂交结合力、专一性都很高，由于没有电荷排斥力，使其杂交形成双螺旋结构的热稳定性高；·PNA探针能够接近位于rRNA高级结构域中的特异靶序列，极大地提高了PNA-FISH检测的灵敏性；·PNA探针一般长度为15 bp；
（3）多彩（Multicolor）FISH技术
·近年来，很多学者致力于以不同染色的标记探针和荧光染料同时检测出多个靶序列的研究，最新的多彩FISH技术可以同时用七种染色进行检测；
·应用多彩FISH时，应注意几个问题：
A. 采用多波峰的滤镜；
B. 混合的荧光染料应该具有狭窄的散射峰，以防止探针间光谱重叠，从而去除背景和避免褪色等问题；
C. 在检测低丰度靶序列时，应采用光稳定的高亮度染料；群落监测
（1）监测微生物群落结构与群落动态
·FISH技术多用于分析单个细胞水平上的微生物群落结构，以rDNA为靶点的寡核苷酸探针，可用于原位鉴定单个细胞；
如：《Science》杂志1999年报道了利用FISH技术检测巨大的纳米比亚硫酸盐细菌，直径0.5 mm，是原核生物的100倍·以16S rRNA为靶序列的FISH技术，可用于检测活性污泥微生物群落的种群组成和数量水平。
同时，可以对特异菌群进行空间定位和原位生理学分析；
如：在高浓度氨工业废水中，通过16S rRNA为靶序列的FISH 技术证实硝化杆菌类细菌存在于活性污泥中；并且，硝化球菌是优势种群。
·在欧美等国，rRNA测序的群落分析已经广泛应用于监测生
物反应器或废水处理厂的生物相；·应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的FISH技术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种群进行空间分布研究；
（2）FISH技术结合流式细胞仪检测微生物
·是诊断和评价微生物群落结构及其动态的最有前景的技术，是近几年来分析土壤活性污泥等环境样品中微生物分拣和数量的有效手段，适用于对有关微生物群落进行快速和频繁的监测，而且自动化操作水平高；
（3）FISH技术应用时的主要问题
·FISH检测的假阳性可能原因：（a）探针设计不合理；（2）微生物自身荧光的干扰；（c）环境样品（如活性污泥或饮用水等）中天然的可发荧光的生物或化学残留物的干扰；（d）培养基、固定方法和封固剂等对荧光信号强度的影响；
·FISH检测的假阴性
可能原因：（a）细胞壁的结构影响探针的渗透力，导致杂交信号强度降低。
革兰氏阳性菌必须进行特殊的固定和前处理，以
提高探针的渗透力；（b）细菌细胞中rRNA含量过低；。