乳酸菌中抑菌物质的分离方法
抑制芽孢杆菌乳酸菌的筛选鉴定及其抗菌物质的分离纯化
抑制芽孢杆菌乳酸菌的筛选鉴定及其抗菌物质的分离纯化赵圣明;曹雪珂;赵岩岩;马汉军;何鸿举【摘要】从朝鲜族辣白菜中分离筛选得到1株对芽孢杆菌具有广谱抑菌活性的菌株JLY-7,该菌株发酵液对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等食品中常见的腐败性和致病性芽孢杆菌具有较强的抑制作用.对菌株JLY-7进行形态学特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,鉴定其为植物乳杆菌.利用正丁醇萃取、凝胶过滤层析(Sephadex LH-20)和半制备液相色谱纯化等手段对该菌株所产抗菌物质进行分离纯化,得到单一活性抑菌组分,经高分辨电喷雾电离质谱确定该抗菌物质的分子量为694.129 Da.通过蛋白酶处理结果表明,该抗菌物质对常见的蛋白酶均非常敏感.本研究可为乳酸菌抗菌物质控制食品中芽孢杆菌奠定理论基础.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)011【总页数】8页(P144-150,165)【关键词】植物乳杆菌;抗菌物质;菌株鉴定;分离;纯化【作者】赵圣明;曹雪珂;赵岩岩;马汉军;何鸿举【作者单位】河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】TS252.54芽孢杆菌属是存在于乳制品、罐装食品、肉制品和面制品中的一类常见细菌,常引起食品腐败甚至是食源性疾病的发生[1-5]。
因其产生的芽孢具有高度的抗逆性,在巴氏杀菌条件下不能够完全被杀死,当环境适宜时,芽孢重新萌发,微生物迅速繁殖,因此引起包装食品腐败变质的微生物主要是芽孢杆菌属。
研究表明枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等能够引起年糕的粘液化[6];嗜热脂肪地芽孢杆菌存在于蔬菜及肉类罐头中导致平酸败坏[7,8];凝结芽孢杆菌导致桶装番茄酱胀罐等[9]。
乳酸菌的分离纯化
1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。
2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。
调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。
改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。
10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。
挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。
稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。
45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。
乳酸菌的分离与筛选具体实验流程
乳酸菌的分离与筛选具体实验流程1. 引言1.1 背景介绍乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们能够以乳酸为代谢产物进行无氧发酵，并且在食品工业、农业和医学领域具有重要的应用价值。
乳酸菌不仅能够促进食品品质的改善和保鲜，还对人体健康具有积极影响。
然而，目前市面上存在许多商业化的乳酸菌制剂，其有效成分及效果并不尽相同。
因此，研究和筛选出优质活性的乳酸菌种类，具有重要意义和广阔前景。
1.2 研究意义本研究旨在通过分离与筛选方法得到高活性的乳酸菌。
通过该研究可以加深我们对乳酸菌及其作用机制的理解，并为特定领域如食品工业、农业等提供先进的技术支持和解决方案。
此外，筛选出具有优良特性的乳酸菌株也将为开发新型功能性食品、生物农药等领域的产品提供重要支持。
因此，本研究对于推动食品工业、农业发展具有积极意义。
1.3 实验目的本实验主要目的如下：- 收集和处理样品：收集富含乳酸菌的样品，并经过适当处理以提高分离效果。
- 选择与制备分离培养基：根据乳酸菌的特性选择适合的培养基并进行制备。
- 设定分离培养条件：通过调控温度、pH值等参数，确定适宜的乳酸菌分离培养条件。
- 鉴定活性乳酸菌指标：确定评价乳酸菌活性和质量的指标，并进行相关试验和检测。
- 设计与实施筛选试验：根据所选指标设计筛选试验，并在实验中采用相应方法进行实施。
- 可行性评估与结果分析：对筛选试验结果进行评估和分析，并总结可行性及相关优化建议。
通过以上实验流程，我们旨在深入了解乳酸菌的特点及其在不同领域中应用潜力，并为进一步研究和开发具有市场竞争力的乳酸菌产品提供理论和实践基础。
2. 乳酸菌的分离方法2.1 样品收集与处理在乳酸菌的分离研究中，样品的选择和处理十分重要。
我们可以选择不同来源的样品，如发酵食品、生态环境等。
收集样品后，需要进行适当的处理以消除非目标微生物对于乳酸菌生长和筛选的干扰。
常见的样品处理方法包括冷藏、过滤、稀释等。
2.2 分离培养基选择与制备为了促进乳酸菌的分离和生长，在实验中需要选择适宜的分离培养基。
乳酸菌代谢物体外抑菌机理探讨
试验研究
乳酸菌代谢物体外抑菌机理探讨
张丽芳
（江苏食品职业技术学院 食品工程系， 江苏 淮安 ２２３００３）
３７ ℃
７０ ℃
１００ ℃
１２１ ℃
２０
抑菌圈直径（ ｍｍ）
１０
０
Ｋ８８
致病性大肠杆菌
Ｋ９９
图 ４ 温度对 １－ ３ 菌株物质与抑菌活性的影响
－ ５－
饲料博览 ２００６ 年第 １２ 期
试验研究
表 １ １－ ３ 菌株所产抑菌物质热稳定性试验结果
处理温度 （ ℃）
处理时间 （ ｍｉｎ）
３７（ 对照）
７０
２５
１４ ｈ
１８ ｈ
２４ ｈ
３０ ｈ
２０
抑菌圈直径 （ ｍｍ）
１５
１０
５
０
Ｋ８８
致病性大肠杆菌
Ｋ９９
图 ２ １－ ３ 菌株不同培养时间发酵滤液
Á
对 Ｋ８８ 及 Ｋ９９ 抑菌效果
１０
活菌数（ ｌｇｃｆｕ·ｍＬ－１）
９
８
７
６ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ ２８ ３２ 培养时间（ ｈ）
图 ３ １－ ３ 菌株在 ＭＲＳ 液体培养基中活菌数变化曲线
Ｄｉｓｃｕｓｓｔｉｏｎ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｓｔａｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒ ｉａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＺＨＡＮＧ Ｌｉｆａｎｇ
（ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｕａｉ’ａｎ ２２３００３， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ ）
《益生性乳酸菌的分离筛选及拮抗沙门氏菌感染功能的研究》范文
《益生性乳酸菌的分离筛选及拮抗沙门氏菌感染功能的研究》篇一一、引言随着人们对健康饮食的日益关注，益生菌的保健作用受到了广泛关注。
其中，益生性乳酸菌因其对宿主健康的多种益处，已成为研究的热点。
本研究旨在分离筛选具有特定功能的益生性乳酸菌，并探讨其拮抗沙门氏菌感染的功能。
这将对开发新型益生菌产品、提高食品安全性具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料主要包括：各种发酵食品样品、培养基、沙门氏菌等。
2. 方法（1）乳酸菌的分离与筛选从各种发酵食品样品中分离出乳酸菌，通过形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，筛选出具有益生特性的乳酸菌。
（2）拮抗沙门氏菌试验采用体外试验方法，将筛选出的乳酸菌与沙门氏菌共同培养，观察乳酸菌对沙门氏菌生长的抑制作用。
（3）功能分析通过基因测序、PCR扩增等分子生物学技术，分析乳酸菌的拮抗机制及功能特点。
三、结果与讨论1. 乳酸菌的分离与筛选结果经过多次试验，我们从不同发酵食品中成功分离出多种乳酸菌。
经过形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，最终筛选出具有益生特性的乳酸菌。
这些乳酸菌在生长过程中能产生大量乳酸，具有良好的耐酸、耐胆盐等特性。
2. 拮抗沙门氏菌试验结果在体外试验中，我们发现筛选出的乳酸菌对沙门氏菌的生长具有明显的抑制作用。
通过观察共培养过程中的生长曲线，发现乳酸菌在生长过程中能产生某种物质，有效抑制沙门氏菌的生长。
这表明乳酸菌具有拮抗沙门氏菌的功能。
3. 功能分析结果通过基因测序、PCR扩增等分子生物学技术，我们分析了乳酸菌的拮抗机制及功能特点。
结果表明，乳酸菌通过产生某种抗菌物质、竞争营养、降低环境pH值等方式，有效抑制沙门氏菌的生长。
这为开发新型益生菌产品、提高食品安全性提供了重要的理论依据。
四、结论本研究成功地从不同发酵食品中分离筛选出具有益生特性的乳酸菌，并发现这些乳酸菌具有拮抗沙门氏菌的功能。
这为开发新型益生菌产品、提高食品安全性提供了重要的理论依据和实际指导。
乳酸细菌分离鉴定实验方法 凌
乳酸细菌分离鉴定实验方法1. 引言乳酸细菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，具有产酸、发酵等特性。
它们在食品行业、农业、医药等领域起着重要作用。
乳酸细菌的分离和鉴定是开展与其相关研究的前提，本文将介绍乳酸细菌分离鉴定的实验方法。
2. 实验材料•乳酸发酵样本（如发酵米饭、酸奶等）•培养基（如MRS培养基）•罗丹明B染色液•麦芽糊精琼脂培养基3. 实验步骤3.1 分离乳酸细菌1.将乳酸发酵样本取1 mL加入10 mL生理盐水中，并进行搅拌均匀。
2.连续稀释梯度：取1 mL悬浮液加入9 mL生理盐水中，得到10-1的稀释液。
重复以上步骤，分别得到10-2、10-3、10-4的稀释液。
3.取少量10^-3的稀释液在无菌工作台上平均涂布于MRS培养基上。
4.使用无菌的三角铁将MRS培养基表面的细菌均匀划开，使得每个细菌分离单元上只有一种细菌。
5.将培养皿倒置放入恒温培养箱中，在37摄氏度下静置24至48小时。
3.2 鉴定乳酸细菌1.观察培养基上的菌落情况，通过形态特征初步判断乳酸细菌。
2.选择培养良好的单独菌落，采用罗丹明B染色法进行初步鉴定。
–取适量的培养菌落，加入1滴罗丹明B染色液，静置5分钟。
–在显微镜下观察染色后的细菌形态，乳酸细菌通常为革兰氏阳性菌（呈现红色染色）。
3.选择阳性菌落上悬浮液进行传代培养。
–取适量的菌落悬浮液，加入新的MRS培养基中，静置24至48小时。
4.进行进一步的鉴定。
–利用麦芽糊精琼脂培养基，通过观察菌落特征鉴定乳酸细菌的种类。
4. 结果分析与讨论通过上述方法，我们可以成功地分离和鉴定乳酸细菌。
乳酸细菌的分离是通过连续稀释梯度和培养基平板法实现的。
鉴定乳酸细菌主要基于其形态特征和罗丹明B染色结果。
进一步通过传代培养和麦芽糊精琼脂培养基来鉴定乳酸细菌的种类。
然而，需要注意的是，乳酸细菌有多个物种，每个物种的生理特性可能有所不同。
因此，在进行鉴定时应结合其他实验方法，如生理生化测试、基因测序等，以进一步明确鉴定结果。
乳酸菌的分离培养
乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的：1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。
4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。
5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。
6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。
明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。
实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。
通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。
酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。
细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。
乳酸菌菌种的分离筛选方法修订稿
乳酸菌菌种的分离筛选方法WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
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乳酸菌中有效抑菌物质的分离纯化方法（肽类物质）
1无菌浓缩乳酸菌发酵液的制备
将乳酸菌以1%接种量接种，置于37°C恒温培养箱静置培养36小时至乳酸
菌生长达到稳定期后期，将发酵液以8000xg转速离心lOmin，取上清液置于-80℃
冰箱中冷冻12h左右，用冷冻干燥机将发酵液冷冻干燥，根据浓缩倍数选择一定
体积的浓度为lOmM的乙酸溶液将冻干后的固体重新溶解，将浓缩后的乳酸菌发
酵液用无菌滤器过滤，得到无菌发酵液，备用。
2固相萃取
固相萃取柱的活化：将3mL甲醇，3mL去离子水，lmL浓度为100mM的乙酸
溶液依次通过固相萃取柱，流速控制在5mL/min。
上样：将浓缩发酵液样品6mL加入固相萃取柱中，流速控制在5mL/min,抽干，
收集样品。
水相洗脱：加入3mL去离子水，抽干，收集样品。
乙腈洗脱：加入3mL乙腈，抽干，收集样品。
3固相萃取小柱的选择和抑制真菌肽类物质的初步分离
将乳酸菌的无菌浓缩发酵液，用两种固相萃取小柱CLEAN-UP C18(封尾)和
CLEAN-UP C18(未封尾)进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙
腈洗脱液和不能被萃取小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相
色谱分离，高效液相色谱的条件为：使用戴安UltiMate3000高效液相色谱仪（电
雾检测器），XBridge BEH300 C18分析柱(4.6x150mm),流动相A液为水，B液为
乙腈（含0.05%三氟乙酸），水相洗脱液，乙腈洗脱液进样体积100ul，洗脱吋间
40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。
4抑菌能力的生物检测
根据液相图像峰将液相分离出的物质置于真空浓缩仪中蒸干，蒸干后向每个
EP管中加入50µl的无菌蒸馏水，溶解后将其转移到96孔板中，向每个孔中加
入50µl的MRS培养基，以50µl的MRS培养基加50µl的无菌蒸馏水作为对照，
向每个孔中再加入1µl的孢子数为106/mL的米曲霉I#。置于30℃的恒温培箱中
培养2-3天，至长出霉菌营养菌体，用酶标仪测定每个样品的OD600。
5乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液中肽类物质的高效液相色谱制备及生物检测
将乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液，固相萃取小柱CLEAN-UP C18(未封尾）
进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙腈洗脱液和不能被萃取
小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相色谱分离，高效液相色
谱的条件为：使用shimadzu LC-6AD半制备高效液相色谱仪，XBridge BEH300
Prep C18制备柱（19x150mm)，流动相A液为水，B液为乙腈（含0.05%三氟乙
酸），进样体积lmL，洗脱时间40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。生
物检测方法见（4)，每个样品设置2组平行。
参考文献：
[1]钱洋.乳酸菌对食品中常见霉菌的抑制和黄曲霉素的去除[D].山东大学，
2012.
发酵液抑菌物质的分离纯化与鉴定方法
一、抑菌物质的粗分
（1）发酵上清液盐析沉淀样制备
取菌株发酵上清液，用饱和度为80%的硫酸铵，4 ℃盐析沉淀 24 h，然后
4000 rpm，离心 20 min，收集沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解。
将 MD44(DM-27)透析袋制成 15 cm 的小段，将透析袋放置于 2% NaHCO
3
和 1mmol/L pH8.0 EDTA 的沸水浴中煮 20 min，然后用蒸馏水或者去离子水浸
泡透析袋，然后将其置入1mmol/L pH 8.0 EDTA 中煮 10 min，并在 4 ℃条件下
贮藏备用。使用前用蒸馏水冲洗透析袋。取10 mL硫酸铵盐析沉淀物水溶液，
在装有蒸馏水的容器中进行透析，透析工作温度为 4 ℃。每隔半小时换一次蒸
馏水。将 2mL BaCl2（10%）溶液放入一试管中，并在试管中滴加 2—3 滴透析
液，如果有白色沉淀出现，则表明表明 SO4-2尚未除净，仍需要透析；如果未出
现沉淀，则表明已经完全透析（王本勋，2002）。
（2）发酵上清超滤浓缩液制备
取15mL超滤离心杯，加入发酵上清液，进行二次离心。3000rmp 离心
20min，后调转速至3500 rmp，离心 20 min。先后用 10 KDa、3 KDa 超滤离心
杯进行二次离心超滤，取截留液及10倍浓缩滤过液进行抑菌实验。
二、半制备高效液相色谱分离纯化抑菌物质
（1）超滤液半制备型液相色谱条件
由半制备型液相色谱（VARIAN Prostar 218，美国）测定。色谱柱为 Pursuit
Rs 5u-C18 柱(150mm*21.2mm)。流动相 A 为 0.05%三氟乙酸甲醇溶液，流动相
B 为 0.05%三氟乙酸水溶液。流速为 1 mL/min，A/B 在 0、30、33 min 时比
率分别为 10: 90、100: 0、100: 0。检测波长为210nm，进样量 1 mL，发酵液样
品处理同 2.2.4.1。
（2）色谱制备液中有机酸检测
利用离子色谱（D20 NEX ICS-3000）测定。色谱柱保护柱为 AG11-HC 柱
(4mm*50mm)，分析柱为 AG11-HC 柱(4mm*250mm)。流动相 A 为 0.8—34 mM
KOH。检测方法：流速为 1 mL/min，在 0—12 min，KOH 浓度为0.8 mM, 12—40
min，KOH 浓度为0.8 mM—34 mM 梯度洗脱，在 40—50min，KOH 浓度为 34
mM。柱温：30℃。乳酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸标品购于中国药品生物
制品检定所。将五种酸配成混标，备用。
（3）
将第 4 部分进 GC-MS，仪器条件如下：色谱仪岛津（SHIMADZU）
GCMS-QP2010-plus色谱柱：RTX-5MS(30m*0.25mm*0.25μm)；进样口温度
260℃；载气 He，1.0mL/min；色谱柱温度：50℃（1min），以 5℃/min 速度升
温至 275℃（3min）；进样量：1.0μL，分流比 10:1，恒流模式；接口温度 280℃，
离子源温度 230℃；EI 电子能量：70eV，质量扫描范围：35amu。
参考文献：
[1]李红娟.抗真菌乳酸菌的筛选及特性研究 [D].中国农业科学院,2011.